木霉P3.9菌株對(duì)枇杷根際真菌多樣性及其群落組成的影響

魯海菊，李曉靜，謝欣悅，沈云玫，陶宏征

（紅河學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 蒙自 661199）

枇杷內(nèi)生木霉（Trichodermasp.）P3.9菌株抗菌譜廣［1］，發(fā)酵工藝簡(jiǎn)單［2-3］，能抑制枇杷根腐病菌［4］，且能成功定殖于枇杷根際［5］及其植株內(nèi)［6］，并能抑制枇杷根際土壤真菌［7］及枇杷內(nèi)生真菌［8］，促進(jìn)枇杷根際細(xì)菌生長(zhǎng)［9］。對(duì)枇杷植株有促生防病［6］作用，具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展［10］，植物未培養(yǎng)病菌得以檢測(cè)［11］，明確了黃豆發(fā)霉優(yōu)勢(shì)病菌為Fusarium moniliforme［12］。黃 連［13］、枸 杞［14］、人參［15-17］、丹參［18］、重樓［19］、茶［20］等中藥，榨菜［21］、馬鈴薯［22］等蔬菜，草莓［23］、臍橙［24］、葡萄［25］等果樹根際土壤真菌多樣性狀況不斷得到揭示，根腐病發(fā)病機(jī)理研究進(jìn)一步深入。發(fā)現(xiàn)黃連根腐病株鐮刀菌屬含量顯著高于健康植株［13］，榨菜根腫病重病田土壤病原真菌數(shù)量增加［21］。菌根菌Glomus intraradices內(nèi)球囊霉［26］處理，可以顯著提高草莓根際土壤有益真菌，減少致病真菌種類。土壤中添加納米銀［27］、生物炭［22，28］、環(huán)保肥料［29］等物質(zhì)能改善植物根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)。土壤微生物群落結(jié)構(gòu)已成為判斷土壤是否健康的生物指標(biāo)［30］。通過科學(xué)耕作，管理根際土壤微生物豐度來實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展，將是一種不錯(cuò)的選擇［31-32］。為進(jìn)一步明確木霉P3.9菌株對(duì)枇杷根腐病的防病促生機(jī)理，本研究利用Illumina平臺(tái)，對(duì)添加木霉P3.9菌株的處理和未添加對(duì)照枇杷根際土壤真菌進(jìn)行高通量測(cè)序，分析其對(duì)枇杷根際真菌多樣性及群落組成的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

內(nèi)生木霉P3.9菌株（Trichoderma atroviride）分離自枇杷主干韌皮部，保存于紅河學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院植物病理學(xué)標(biāo)本室。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，自來水1000 mL；pH 7.0。

在121℃高壓滅菌30 min。材料均購自農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)及試劑公司，試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 木霉菌懸液接種于根際土壤的方法

將試管斜面保存的P3.9菌株移入PDA平板上活化，待菌落長(zhǎng)滿全皿后，用打孔器取5 mm的菌餅，接入PDA平板中央。共培養(yǎng)5皿，置28℃培養(yǎng)5～7 d；待菌落長(zhǎng)滿全皿后，收集所有培養(yǎng)物至粉碎機(jī)，并加入適量無菌水，充分打勻，制成菌懸液，調(diào)整孢子濃度至1×106cfu/mL備用。枇杷嫁接苗種植于營養(yǎng)袋（23 cm×18 cm）中，苗齡為1年時(shí)做接種試驗(yàn)。用上述木霉孢子懸浮液灌根，500 mL/株，灌根等量清水做為對(duì)照，設(shè)10個(gè)重復(fù)，常規(guī)肥水管理。

1.2.2 枇杷根際土樣采集

灌根木霉孢子懸浮液第10、20、30、40、50、60、70、80、90 d，用不銹鋼環(huán)刀土鉆，高0.5 m，鉆頭直徑38 mm；處理和對(duì)照枇杷苗分別隨機(jī)取3株，每株用5點(diǎn)取樣法，采集深度5～20 cm的根際土樣，除去枯枝落葉，過0.075 mm篩，用四分法充分混勻土樣備用。每個(gè)處理取3個(gè)重復(fù)送檢。

1.2.3 枇杷根際土壤總DNA提取

用MIO-BIO PowerSoil DNA Isolation Kit試劑盒，按說明提取。

1.2.4 設(shè)計(jì)并合成引物接頭

根據(jù)illumina Miseq高通量測(cè)序要求，進(jìn)行雙向測(cè)序，設(shè)計(jì)目標(biāo)區(qū)域和帶有“5′Miseq接頭-barcode-測(cè)序引物-特異引物-3′”的融合引物。

F 5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACbarcode-TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-特異引物-3′；

R 5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATbarcode-GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAAT TCCA-特異引物-3′。

1.2.5 PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物純化定量及均一化

采用兩步PCR擴(kuò)增的方法，使用ABI9700PCR儀，一次PCR擴(kuò)增體系：5xBuffer 10μL，dNTP（10 mmol/L）1μL，Phusion超保真DNA聚合酶1 U，F(xiàn)/R內(nèi)側(cè)引物（10 μmol/L）各1μL，模板5～50 ng，ddH2O補(bǔ)至50μL。一次PCR擴(kuò)增程序：94℃ 2 min預(yù)變性，94℃ 30 s變性，50～56℃ 30 s退火，72℃30 s擴(kuò)增，72℃ 5 min延伸，10℃保溫，25～35個(gè)循環(huán)。二次PCR擴(kuò)增體系：5xBuffer 8μL，dNTP（10 mmol/L）1μL，Phusion超 保 真DNA聚 合 酶0.8U，F(xiàn)/R外側(cè)引物（10 μmol/L）各1μL，模板5 uL，ddH2O補(bǔ)至40μL。二次PCR擴(kuò)增程序：94℃2 min預(yù)變性，94℃ 30 s變性，56℃ 30 s退火，72℃ 30 s擴(kuò)增，72℃ 5 min延伸，10℃保溫，8個(gè)循環(huán)。

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，于2%瓊脂糖凝膠電泳切膠回收（電泳槽保持干凈，更換電泳緩沖液）。采用AXYGEN公司的AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒回收。回收產(chǎn)物進(jìn)行qPCR定量。采用FTC-3000TM real-time PCR儀對(duì)膠回收產(chǎn)物進(jìn)行定量。

1.2.6 MiSeq高通量測(cè)序

54個(gè)樣品送微基生物科技（上海）有限公司測(cè)序。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

1.2.7.1 Operational Taxonomic Units（OTU）聚類 使用USEARCH和mothur去除沒有注釋結(jié)果的OTU，去除注釋結(jié)果不屬于分析項(xiàng)目中的物種。

通 過mothur（classify.seqs）將OTU代 表 序列與數(shù)據(jù)庫比對(duì)進(jìn)行物種注釋，置信度閾值設(shè)置為0.8。

1.2.7.2 群落結(jié)構(gòu)組成韋恩圖 選用相似水平為97%的OTU樣品表，用mothur和R語言作圖。

1.2.7.3 基于OTU的PCA分析 使用97%相似度的OTU，用mothur作圖。

1.2.7.4 群落結(jié)構(gòu)組成柱狀圖 基于每個(gè)樣品在每個(gè)OTU的豐度統(tǒng)計(jì)表，利用R語言工具作圖。

1.2.7.5 Anova_oneway組間差異比較 選擇P<0.05的物種繪制柱形圖，每個(gè)柱子為差異物種的相對(duì)豐度，誤差線為標(biāo)準(zhǔn)誤，其中*代表0.01

2 結(jié)果與分析

2.1 引入木霉P3.9菌株對(duì)枇杷根際土壤真菌多樣性及群落豐度的影響

由表1可知，枇杷根際土壤中引入木霉P3.9菌株10～90 d之間，根際土壤真菌ACE、Chao、香農(nóng)和辛普森指數(shù)與不引入木霉P3.9菌株的對(duì)照差異不顯著。說明木霉P3.9菌株不影響枇杷根際土壤真菌群落豐度和群落多樣性。

表1 木霉P3.9菌株對(duì)枇杷根際土壤真菌多樣性及群落豐度的影響

2.2 引入木霉P3.9菌株對(duì)枇杷根際土壤真菌群落數(shù)量的影響

由圖1可知，枇杷根際引入木霉P3.9菌株處理與未引入對(duì)照共有的根際真菌有1304種，引入木霉P3.9菌株處理枇杷根際土壤獨(dú)有的根際真菌有588種，未引入木霉對(duì)照獨(dú)有的根際真菌有590種。說明枇杷根際引入木霉P3.9菌株能抑制土著真菌生長(zhǎng)，導(dǎo)致枇杷根際真菌數(shù)量減少2種，因此枇杷根際真菌群落組成發(fā)生變化。

2.3 引入木霉P3.9菌株對(duì)枇杷根際真菌多樣性的持續(xù)影響

由圖2可知，枇杷根際土壤引入木霉P3.9菌株之后，PC1值為42.05%，表示不同取樣時(shí)間檢測(cè)枇杷根際真菌群落差異可以解釋全面分析結(jié)果的42.05%。在引入木霉P3.9菌株10～30 d之間，引入木霉的處理和未引入對(duì)照在PCA坐標(biāo)圖上幾乎聚集在一起；40～90 d之間，引入木霉的處理和未引入對(duì)照在PCA坐標(biāo)圖上分散開來。說明引入木霉P3.9菌株30 d之內(nèi)，枇杷根際真菌群落幾乎未發(fā)生改變；40～90 d之間，枇杷根際真菌群落組成發(fā)生改變。

2.4 引入木霉P3.9菌株對(duì)枇杷根際土壤真菌群落組成的影響

2.4.1 引入木霉P3.9菌株對(duì)枇杷根際土壤真菌群落屬分類地位的影響

由圖3可知，枇杷根際土壤真菌注釋到58個(gè)已知屬，其中物種豐度占前15位的依次為Fusarium、Mortierella、Trichoderma、Chaetomium、Gibberella、Ilyonectria、Phoma、Monographella、Fusicolla、Cladosporium、Acremonium、Aspergillus、Lasiodiplodia、Stephanonectria、Lectera。由 圖4可知，引入木霉P3.9菌株處理與未引入對(duì)照枇杷根際土壤真菌，在屬分類水平上物種豐度差異顯著。導(dǎo)致枇杷根際土壤真菌注釋到的15個(gè)已知屬物種豐度發(fā)生改變。物種豐度占前15位的優(yōu)勢(shì)屬中，有5個(gè)屬物種豐度發(fā)生改變，占比達(dá)1/3。其中優(yōu)勢(shì)屬M(fèi)ortierella極顯著增加（0.001

2.4.2 引入木霉P3.9菌株對(duì)枇杷根際土壤真菌群落種分類地位的影響

由圖5可知，枇杷根際土壤真菌注釋到49個(gè)已知種，其中物種豐度占前20位的依次為Fusarium brachygibbosum、Ilyonectria macrodidyma、Mortierella alpina、Phoma omnivirens、Monographella cucumerina、Fusicolla acetilerea、Acremonium antarcticum、Stephanonectria keithii、Penicillium neocrassum、Penicillium citrinum、Podospora communis、Sarocladium strictum、Purpureocillium lavendulum、Penicillium virgatum、Metacordyceps chlamydosporia、Mortierella exigua、Clonostachys rosea、Subulicystidium perlongisporum、Hyaloseta nolinae和Clonostachys miodochiali。由 圖6可 知，引入木霉P3.9菌株處理與未引入對(duì)照枇杷根際土壤真菌，在種分類水平上差異顯著，導(dǎo)致枇杷根際土壤真菌注釋到的14個(gè)已知種物種豐度發(fā)生改變。物種豐度占前20位的優(yōu)勢(shì)種中，有4個(gè)種物種豐度發(fā)生改變，占比為1/5。其中優(yōu)勢(shì)種Mortierella alpina和Mortierella exigua顯著增加（0.01

3 討論

枇杷根際土壤引入木霉P3.9菌株對(duì)枇杷根際真菌多樣性無不良影響，但對(duì)其真菌群落組成影響顯著，導(dǎo)致根際真菌減少2個(gè)種。從屬水平分析，被孢霉屬M(fèi)ortierella、木霉屬Trichoderma、蠟蚧菌屬Lecanicillium增加，裂殼屬Schizothecium、莖點(diǎn)霉屬Phoma、曲霉屬Aspergillus、Lectera、柄孢殼菌屬Podospora減少；從種水平分析，Mortierella alpina、Mortierella exigua、Penicillium decumbens和Lecanicillium primulinum增加，Penicillium citrinum和Coprinus phaeopunctatus、Phoma omnivirens、Acremonium fusidioides、Cryptocossus podzolicus、Aspergillus proliferans、Leptodiscella chlamydospora和Penicillium menonorum減少。據(jù)報(bào)道，大興安嶺地區(qū)土壤優(yōu)勢(shì)真菌為被孢霉屬［33］。被孢霉屬［34］真菌可以排斥和抑制其它土壤微生物［35］，高山被孢霉M. alpina能產(chǎn)生倍半萜類化合物［36］，具有抑菌作用。長(zhǎng)期施有機(jī)肥，玉米根際土壤被孢霉屬數(shù)量急劇增加［37］，與本研究結(jié)果一致。被孢霉在土壤養(yǎng)分濃度提升過程中貢獻(xiàn)最大，能產(chǎn)生抗生素，調(diào)控玉米根際激素水平，對(duì)玉米有促生防病作用［37］。添加被孢霉能修復(fù)三七連作土壤真菌群落，預(yù)防三七根腐病［38］。斜臥青霉菌Penicillium decumbens［39］有溶磷作用，對(duì)玉米有促生作用。蠟蚧菌屬大多為昆蟲寄生真菌，能寄生于柑橘木虱［40］，從而減輕柑橘黃龍病發(fā)生。說明引入木霉P3.9菌株能促使枇杷根際土壤有益真菌增加，增強(qiáng)枇杷根際土壤肥力及抑菌作用，對(duì)枇杷植株起到促生防病作用，此結(jié)論與筆者前期研究結(jié)果一致［6］。莖點(diǎn)霉屬Phoma真菌能引起核桃樹腐爛病［41］，葡萄莖枯病［42］；曲霉屬Aspergillus真菌能引起棗果［43］、生菜［44］腐爛病、煙葉霉變［45］；Penicillium citrinum能引起柑橘采后腐爛病［46］，說明引入木霉P3.9菌株能促使枇杷根際土壤病原真菌減少。綜上所述，木霉P3.9菌株對(duì)枇杷根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)有改善作用，有益真菌數(shù)量增多，有害真菌數(shù)量減少，對(duì)連作枇杷根際土壤有潛在修復(fù)作用。

4 結(jié)論

枇杷根際引入木霉P3.9菌株不會(huì)改變枇杷根際土壤真菌群落多樣性，改變了根際真菌群落組成。有益真菌物種豐度增加，有害真菌物種豐度減少，對(duì)枇杷連作根際土壤有潛在修復(fù)作用。

枇杷根際引入木霉P3.9菌株可以促進(jìn)Mortierella alpina和Mortierella exigua生長(zhǎng)，對(duì)枇杷根際土壤肥力有提升作用。

綜上，枇杷內(nèi)生木霉P3.9菌株對(duì)枇杷植株具有促生防病作用，應(yīng)用前景廣闊。