污泥糞大腸菌群酶底物法替代多管發酵法的可行性研究

包亮亮

(甘肅省地質礦產勘查開發局第三地質礦產勘查院，甘肅 蘭州 730050)

污泥是污水處理構筑物的沉淀物，含有大量的微生物，其中的糞大腸菌群數的高低表明了底泥的污染程度，也反映了對人體健康危害性的大小。《城鎮污水處理廠污染物排放標準》(GB18918-2002)明確規定了污泥中糞大腸菌群的排放標準、檢測方法，以及控制標準[1]；《城市污水處理廠污泥檢驗方法》(CJ/T221-2005)為檢測城鎮污水處理廠污泥中糞大腸菌群提供了檢測技術規范[2]。測定污泥中的糞大腸菌群至今仍采用多管發酵法和濾膜法，標準方法至今沒有改進。我國雖然在2006年《生活飲用水標準檢驗方法》[3]中采用酶底物方法，但其推廣速度慢，一直沒有得到發展。直到2018年生態環境部發布HJ1001-2018《水質總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測定酶底物法》后[4]，水質檢測糞大腸菌群的酶底物法才得到推廣和應用，但污泥中的糞大腸菌群檢測工作還停留在多管發酵法、濾膜法階段。目前，酶底物法已經在50多個發達國家得到廣泛應用，美國90%以上的實驗室使用酶底物法，因此對污泥糞大腸菌群酶底物法的推廣以及可行性研究具有重要意義。

1 多管發酵法

1.1 方法原理

多管發酵法又稱多管發酵二步法[5]。(參照水質糞大腸菌群多管發酵檢測方法[6])將污泥稀釋樣品加入到乳糖蛋白胨培養基試管中，經 37 ℃ 初發酵富集培養，大腸菌群分解乳糖產酸產氣，產氣的酸使溴甲酚紫指示劑由紫色變為黃色，再經 44.5 ℃ 復發酵培養，培養基中的膽鹽三號可抑制干擾菌的生長，最后產氣的細菌確定為糞大腸菌群。

1.2 儀器和試劑

1)儀器。高壓蒸汽滅菌器；電熱恒溫培養箱：37 ℃，44.5 ℃ 可調；天平；試管等。

2)試劑。乳糖蛋白胨培養液、EC 培養基、無菌水等。

1.3 樣品的預處理和制備

稱取污泥樣品 10 g 于三角瓶，加 90 mL 滅菌生理鹽水，混勻5～10 min，制成1∶10(質量分數，下同)均勻稀釋液。按此方法依次制成1∶100、1∶1000等不同質量分數的混勻菌液，推薦多管發酵法稀釋度范圍為質量分數：10-2～10-8，選擇3個連續稀釋度的混勻樣品進行檢測。

1.4 檢測流程

1)初發酵試驗。在5個裝有 5 mL 的三倍乳糖蛋白胨培養基試管中(內有導管)，加入 10 mL 混勻稀釋的污泥菌液；于各裝有 10 mL 的單倍乳糖蛋白胨培養液的5個試管中加入 1 mL 混勻稀釋的污泥菌液；于剩余5個試管中加入 0.1 mL 混勻稀釋的污泥菌液。均置于(37±0.5)℃條件下，培養 24 h 觀察。發酵試管顏色變黃為產酸，玻璃倒管內有氣泡為產氣。產酸和產氣的試管表明試驗呈陽性。如在倒管內產氣不明顯，可輕拍試管，有小氣泡升起的也為陽性。

2)復發酵試驗。將初發酵試驗呈陽性或疑似陽性的培養物接種到有EC培養基的試管中。在(44.5±0.5)℃ 下培養 24 h 后觀察，產氣證實為糞大腸菌群陽性，即證實有糞大腸菌群存在。查閱HJ347.2-2018中的MPN表，用公式MPN值=MPN指數×(10 mL/接種量最大值)[7]，換算得出 1 g(mL)污泥中糞大腸菌群數。

2 酶底物法

2.1 方法原理

方法原理采用水質糞大腸菌群酶底物法[4]。在(44.5 ±0.5)℃下培養 24 h，大腸菌群細菌能產生β-半乳糖苷酶和大腸桿菌的β-葡糖醛酸酶分解代謝。選擇培養基中的色原底物鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)分解為黃色的鄰硝基苯盼(ONP)腸桿菌科細菌，培養基呈現黃色反應。定量分析水中糞大腸菌群的最大可能數。

2.2 儀器和試劑

1)儀器。程控定量封口機，97孔定量盤，100 mL 無菌采樣瓶，恒溫培養箱，手提式壓力蒸汽滅菌鍋，稀釋瓶，移液管等。

2)試劑。MMO-MUG培養基(IDEXX科立得Colilert試劑)，無菌水。

2.3 樣品預處理

樣品的預處理同1.3。選擇合適稀釋度的樣品，對于準確測定污泥中糞大腸菌群的最大可能數具有重要意義，推薦污泥樣品酶底物法稀釋度范圍為(質量分數)：10-3～10-8。

2.4 檢測流程

量取 100 mL 稀釋混勻的樣品于無菌采樣瓶中，加入MMO-MUG 培養基粉末，充分混勻，使培養基完全溶解；全部倒入定量盤內，釋放氣泡，用程控定量封口機封口。于(44.5±0.5)℃培養 24 h 后對照標準陽性板判讀結果。查閱MPN表對應的 100 mL 水中糞大腸菌群的最可能數，換算得出 1 g(mL)污泥中糞大腸菌群的最可能數。

3 結果分析與對比

采集污水處理廠、醫療機構、城市排水溝3大類污泥樣品共30組，分別采用多管發酵法和酶底物法檢測，并對檢測結果進行分析對比。

本文原始數據都以10為底，對數轉化后使用EXCEL和SPSS.25統計軟件進行計算和統計分析。

3.1 兩種檢測結果比較

對檢測結果進行對比分析得出(圖1)，多管發酵法個別檢測結果略大于酶底物法，這是由于樣品在初發酵試驗之后，還需復發酵試驗，在此過程中容易受到到外界因素的干擾和不確定因素的影響，以及污泥樣品的不均性，造成檢測結果出現較大差異的情形，而酶底物法采用先進的密封培養技術，沒有二次污染[8]，且由于科立得試劑獨有的抑菌功能，能抑制200萬個異養菌生長，從而使出現假陽性和假陰性的概率大大降低[9]。

圖1 30組污泥樣品檢測結果比較

3.2 試驗結果分析

對30組檢測結果的t-檢驗分析得出，相關系數(r)為：0.925。r≥0.8,說明這兩種方法之間高度相關。tStat=0.447,t0.05(30)=2.045,tStat﹤t0.05(30),P=0.658。P>0.05，即兩種分析方法檢測結果無顯著差異。結果分析見圖2。

圖2 檢測結果的線性回歸分析

3.3 兩種方法精密度試驗對比與分析

在該批樣品中選取低濃度、中濃度、高濃度污泥樣品各1份，按不同方法各進行了6次重復測定，并對精密度測試結果作分析比較。結果見表1。

從表1表明，無論是對于低濃度、中濃度，還是高濃度的樣品，酶底物法的RSD%﹥多管發酵法RSD%，酶底物法重復性r明顯小于多管發酵法，說明酶底物法檢測數據波動較小。經F檢驗，低濃度、中濃度、高濃度F計算值分別為6.57、14.30、39.22。F計算值﹥F0.05，(5,5)=5.05，說明兩種檢測方法的精密度有顯著差異，酶底物法精密度明顯大于多管發酵法。

表1 多管發酵法與酶底物法精密度的比較

4 酶底物法替代多管發酵法的可行性探討

4.1 兩種檢測方法的優點與缺點對比

酶底物法主要是采用先進的酶技術密封培養，易操作，檢測流程短，無需確認實驗，假陽性概率較低，精密度高，但材料成本相對較高，其檢測費用比較昂貴，人工成本較低，可以彌補傳統多管發酵法的不足。

多管發酵法，其操作步驟繁瑣，整個操作過程容易受到外界環境的干擾，控制成本方面具有優勢，技術操作簡單，檢測時間較長，需進行確認試驗，準確度相對酶底物法略低，人工成本較高，大批量樣品檢測難度較大。兩種方法的優點與缺點對比見表2。

表2 多管發酵法與酶底物法優點與缺點的對比

4.2 實驗結果比較分析

對檢測結果的t檢驗分析，兩種檢測方法無統計學意義上的差異，兩種分析方法之間高度相關，其檢測效果相同，兩種方法檢測結果無顯著差異。

4.3 兩種方法精密度檢驗

通過對精密度的分析，兩種檢測方法的精密度之間存在顯著性差異，酶底物法精密度高于多管發酵法，且兩種檢測方法的精密度均在受控范圍之內。

5 結論

隨著微生物檢測技術的不斷提高，高效、準確、環保、低廉的微生物檢測技術將是未來發展的主要方向。污泥糞大腸菌群采用酶底物法檢測效果顯著，與傳統的多管發酵法比較檢測結果基本一致，兩種方法之間高度相關，無顯著性差異，檢測結果無系統誤差。污泥糞大腸菌群酶底物法檢測精密度高，操作流程簡單，檢測時間短，工作效率高，其檢測效果高于多管發酵法，適用于各種固體類型的污泥、堆肥、肥料、土壤中的糞大腸菌群檢測。酶底物法是現階段代替傳統多管發酵法最可行有效的替代方法之一。