紫丹參水溶性及脂溶性成分提取工藝優(yōu)化*

朱麗媛，彭朝蕊，周木艷，趙 興，陳光明

(云南新興職業(yè)學(xué)院 藥學(xué)院，云南 昆明 651500)

紫丹參系唇形科鼠尾草屬植物云南鼠尾草(Salvia yunnanensis C.H.Wright)的干燥根及根莖[1]，又名云南鼠尾草、小丹參、滇丹參等[2]，彝族語(yǔ)音譯名為呆乃色[1]。它與著名中藥丹參同屬于唇形科鼠尾草屬植物，且具有與丹參相似的藥理活性[3]，往往作為丹參的替代品使用[4]。但紫丹參與丹參還是存在明顯區(qū)別，從分布區(qū)域到化學(xué)成分中的主要成分含量、藥理作用程度等都有所不同，固不可將二者混為一談[5-9]。

紫丹參主要分布于云南、四川、貴州等省，主要來(lái)自于野外，一直作為云南地方習(xí)用藥材，用藥歷史悠久[10]。民間主要將紫丹參用于治療婦科和骨傷科疾病，具有活血調(diào)經(jīng)、祛瘀生新、鎮(zhèn)靜止痛、除煩安神、活血通經(jīng)等功效[1-2，11-14]。云南鼠尾草藥材曾在云南大理州年產(chǎn)達(dá) 10000 kg 以上，行銷華北、華中、中南和華南等各省區(qū)[15]，在大理民間常與馬廠當(dāng)歸配伍使用[16]。紫丹參療效廣泛，含有丹參酮類、酚酸類等成分，近年來(lái)因?qū)ζ淇寡“寰奂⒎乐喂谛牟〉痊F(xiàn)代藥理作用的深入研究而日益受到重視[17-18]。以紫丹參為處方主藥被國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)收載的中藥制劑多達(dá)10個(gè)，其中丹莪婦康煎膏、紫燈膠囊、紫丹活血片等均療效顯著[19-20]。目前，已有學(xué)者對(duì)紫丹參資源、化學(xué)成分、藥理作用、提取工藝等方面進(jìn)行了研究[17-21]，但對(duì)紫丹參的提取工藝只停留在對(duì)其水溶性或脂溶性各成分單獨(dú)研究[22-25]，暫未見其脂溶性及水溶性總成分的提取工藝。本研究以丹酚酸 B 和丹參酮 IIA 總含量為指標(biāo)，通過(guò)對(duì)紫丹參的提取次數(shù)、時(shí)間、料液比以及溶劑(乙醇)濃度進(jìn)行單因素考察，采取回流提取法，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法優(yōu)選紫丹參提取工藝，為充分利用該藥提供重要的依據(jù)與參考。

1 儀器與材料

1.1 藥材來(lái)源

紫丹參藥材購(gòu)自云南省宣威市羊場(chǎng)鎮(zhèn)，經(jīng)云南新興職業(yè)學(xué)院藥學(xué)院楊艷娟副教授鑒定為唇形科鼠尾草屬植物云南鼠尾草(Salvia yunnanensis C.H.Wright)的干燥根及根莖。

1.2 儀器

Agilent 1260 高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent)；BT25S分析天平(賽多利斯儀器有限公司)；CP124C-OHAUS電子天平(奧豪斯儀器常州有限公司)；JP-1500B高速多功能粉碎機(jī)(永康市久品工貿(mào)有限公司)；SK3300超聲機(jī)(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)；電熱恒溫水浴鍋(天津泰斯制儀器有限公司)；EYELA N-1300型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛(ài)朗儀器有限公司)。

1.3 試劑

丹酚酸B對(duì)照品(批號(hào): 20120901，森嵐科技有限公司，含量：91.04%)；丹參酮IIA對(duì)照品(批號(hào): 19032005，森嵐科技有限公司，含量：94.55%)。 無(wú)水乙醇(分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)；乙腈(色譜純，德國(guó)MERCK)；甲醇(分析純，利安隆博華醫(yī)藥化學(xué)有限公司)；磷酸(分析純，廣東光華科技股份有限公司)；純凈水(濟(jì)南哇哈哈恒楓飲料有限公司)。

2 方法與結(jié)果[26]

2.1 建立紫丹參丹酚酸 B 和丹參酮IIA測(cè)定方法

2.1.1 色譜條件

Agilent 1260高效液相色譜系統(tǒng)，色譜柱：中譜科技RD-C18(5 μm, 4.6×250 mm)。流動(dòng)相：乙腈(A)— 0.1% 磷酸溶液(B)，梯度洗脫，0～5 min，30%～35% A; 5～10 min，35% A; 10～20 min，35%～75% A; 20～25 min，75%～80% A;25～30 min，80%～85% A;30～35 min，85%～5% A;35～40 min,5% A。流速：1 mL/min。檢測(cè)波長(zhǎng)：丹酚酸 B 286 nm，丹參酮IIA 270 nm。柱溫：30 ℃。進(jìn)樣量：1 μL。對(duì)照品和待測(cè)樣品的色譜圖見圖1。

圖1 混標(biāo)(A)和紫丹參樣品(B)的HPLC色譜圖

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密稱取丹酚酸B和丹參酮IIA對(duì)照品若干，溶于甲醇制成混合對(duì)照品母液，將母液逐級(jí)稀釋成各成分質(zhì)量濃度0.31～10.03 mg/mL、0.06～2.07 mg/mL 的混合對(duì)照品溶液，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，以縱坐標(biāo)為峰面積，橫坐標(biāo)為對(duì)照品的質(zhì)量濃度(mg/mL)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合回歸方程，結(jié)果見表1。

表1 丹酚酸 B 和丹參酮IIA的線性回歸方程與相關(guān)系數(shù)及線性范圍

2.1.3 供試品溶液制備

精密稱定紫丹參粉末 5 g，按正交試驗(yàn)安排表進(jìn)行試驗(yàn)，合并濾液濃縮至 25 mL 容量瓶中，甲醇定容至刻度，混勻，微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.1.4 方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液 1 μL，連續(xù)進(jìn)樣 6 次，記錄色譜圖。丹酚酸B 和丹參酮IIA的RSD分別為0.17 % 和 0.33 %，表明儀器精密度好。

重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱定紫丹參粉末 5 g，按照供試品溶液制備方法制備，并連續(xù)進(jìn)樣 6 次，記錄色譜圖。丹酚酸B和丹參酮IIA的RSD分別為0.68 %和1.55 %，表明重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液，分別在 0、2、4、6、8、12 h 進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。丹酚酸B和丹參酮IIA的RSD分別為0.44 %和1.72 %，表明供試品溶液在 12 h 內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的6個(gè)供試品溶液，加入一定量的丹酚酸B、丹參酮ⅡA對(duì)照品，按制備方法制備，測(cè)定制備含量，計(jì)算平均回收率。丹酚酸B和丹參酮IIA的平均加樣回收率分別為101.47%和98.71%，RSD分別為2.40%和2.06%。

2.2 紫丹參提取工藝研究

2.2.1 單因素考察

以乙醇作為提取溶媒，對(duì)料液比、乙醇分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間進(jìn)行單因素考察。

1)料液比考察。準(zhǔn)確稱取紫丹參粉末5份，每份 5 g，分別以料液比1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10(g/mL)加入 70% 乙醇，于 80 ℃ 水浴回流提取 1 h，過(guò)濾，濾液濃縮至 25 mL 容量瓶中，甲醇定容至刻度，混勻，測(cè)定丹酚酸B、丹參酮ⅡA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表2。

表2 料液比考察結(jié)果

2)乙醇考察。準(zhǔn)確稱取紫丹參粉末5份，每份 5 g，分別加入8倍量(40 mL)的50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇，于 80 ℃ 水浴回流提取 1 h，過(guò)濾，濾液濃縮至 25 mL 容量瓶中，甲醇定容至刻度，混勻，測(cè)定丹酚酸B、丹參酮ⅡA含量，結(jié)果見表3。

表3 乙醇濃度考察結(jié)果

3)提取時(shí)間考察。準(zhǔn)確稱取紫丹參粉末5份，每份 5 g，分別加入8倍量(40 mL)的70%乙醇 80 ℃ 水浴加熱回流提取 30 min、60 min、90 min、120 min、150 min，過(guò)濾，濾液濃縮至 25 mL 容量瓶中，甲醇定容至刻度，混勻，測(cè)定丹酚酸B、丹參酮ⅡA含量，結(jié)果見表4。

表4 提取時(shí)間考察結(jié)果

2.2.2 正交試驗(yàn)方案及結(jié)果分析

在單因素試驗(yàn)考察的基礎(chǔ)上，根據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以丹酚酸B、丹參酮ⅡA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選擇料液比(g/mL) (A)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(B)、提取時(shí)間(C)進(jìn)行考察，采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選紫丹參水溶性及脂溶性成分提取工藝，因素水平見表5。丹酚酸B及丹參酮ⅡA質(zhì)量分?jǐn)?shù)各占50%進(jìn)行綜合評(píng)分，結(jié)果見表6，方差分析結(jié)果見表7。

表5 正交試驗(yàn)因素水平表

表6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及直觀分析表

表7 正交試驗(yàn)方差分析表

直觀分析可知，影響丹酚酸B、丹參酮ⅡA兩種成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)總和的因素大小順序?yàn)椋禾崛r(shí)間>乙醇體積分?jǐn)?shù)>料液比，且提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)在提取過(guò)程中起重要作用(P<0.05)，確定最佳提取參數(shù)為A2B2C3，即加入 8倍量的75%乙醇在 80 ℃ 水浴加熱回流提取 120 min。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果篩選的工藝條件進(jìn)行3組驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見表8。以優(yōu)化工藝作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行紫丹參提取，其提取液中丹酚酸B和丹參酮IIA的含量都較高，達(dá)到 31.73 mg/g。試驗(yàn)表明，所優(yōu)化的提取工藝合理可行，且結(jié)果穩(wěn)定可靠。

表8 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

本研究選擇丹酚酸 B 和丹參酮 IIA 作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，因其為紫丹參的主要有效成分，在治療心血管疾病中有很好的治療作用，含量較其他成分高，也是水溶性成分和脂溶性成分的代表性成分，可以更全面地反映出紫丹參的提取效果。丹酚酸 B 成分遇熱不穩(wěn)定，為盡量減少由于干燥時(shí)丹酚酸 B 成分的損耗導(dǎo)致含量測(cè)定中的其提取的量降低[22]，故將樣品濃縮后進(jìn)行定容。

本研究中，首先采用單因素試驗(yàn)考察了紫丹參中丹酚酸 B 和丹參酮 IIA的提取次數(shù)、料液比、乙醇濃度、提取時(shí)間，在此基礎(chǔ)上，采用 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選紫丹參的提取工藝。結(jié)果顯示，紫丹參中丹酚酸 B 和丹參酮 IIA提取效率的主要影響因素為乙醇，其次是提取次數(shù)，得到最佳提取工藝為：8倍量(40 mL)的75%乙醇在 80 ℃ 水浴加熱回流提取 120 min。重復(fù)驗(yàn)證最佳工藝實(shí)驗(yàn)提取的丹酚酸 B 和丹參酮 IIA的總含量為 31.73 mg/g。表明該方法提取效率較高，重現(xiàn)性好，同時(shí)操作簡(jiǎn)便，可為紫丹參的進(jìn)一步開發(fā)利用提供可靠依據(jù)。