基于TLR4∕NF-κB信號通路探討銀萊湯治療幼齡大鼠肺炎模型的作用機制*

胡 莉 白 辰 龍超君 朱敬儒 卓麗清 劉邵陽 于 河 谷曉紅 劉鐵鋼

（北京中醫藥大學，北京 100029）

小兒肺炎是由病原體感染或其他因素所致的肺部炎癥，冬春季發病較多，臨床以發熱、咳嗽、痰壅、氣息、鼻煽為主要癥狀[1]。小兒肺炎是嬰幼兒死亡的常見原因，為我國重點防治的小兒疾病。西醫治療本病以予抗生素、抗病毒藥物等為主，長期使用易產生耐藥性以及許多不良反應。中醫治療小兒肺炎在縮短疾病療程，改善臨床癥狀及減少不良反應方面具有顯著優勢。

銀萊湯是首都名中醫谷曉紅教授的臨床驗方，該方以肺與胃腸同治法組方，由金銀花、萊菔子、黃芩、連翹、魚腥草、全瓜蔞、前胡組成，肺胃兩清、宣通，臨床治療小兒胃腸積熱合并肺炎療效確切。前期研究發現，銀萊湯具有明確治療肺炎的作用[2-3]，但其作用機制并未明確。本研究建立脂多糖（LPS）誘導的幼齡大鼠肺炎模型，旨在探究銀萊湯對幼齡大鼠肺炎模型的抗炎作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠40只，4周齡，體質量（100±10）g，購自維通利華（北京）實驗動物中心，合格證號110011211102012854。動物飼養于北京中醫藥大學的基礎醫學科學院的動物實驗中心，自由攝食和飲水，室溫（25±2）℃，相對濕度50%～60%，晝夜12 h交替。適應性喂養3 d后進行實驗，所有動物實驗均嚴格按照實驗動物管理法規的規定和總則建議進行（倫理審批號BUCM-4-2021030305-1046）。

1.2 試藥與儀器 銀萊湯中藥配方顆粒全方由金銀花30 g，萊菔子10 g，黃芩10 g，連翹15 g，全瓜蔞15 g，前胡10 g，魚腥草20 g組成，加水煎制濃縮為質量濃度為0.56 g∕mL的藥液（藥材購自北京康仁堂藥業有限公司）。LPS，購自美國Sigma公司，批號：L2880。醋酸潑尼松片，購于浙江仙琚制藥股份有限公司。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA-Kit（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，E-EL-R2856c）、白細胞介素-6（IL-6）ELISA-Kit（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，EEL-R0015c）、白細胞介素-1β（IL-1β）ELISA-Kit（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，E-EL-R0012c）。兔多抗tlr4（武漢三鷹生物技術有限公司，SC-109312）、兔多抗P65（武漢三鷹生物技術有限公司，10745-1-AP）；鼠單抗IκBα[賽默飛世爾科技（中國）有限公司，4814]；兔單抗p-ikbα（美國Abcam公司，Ab133462）、兔單抗TRAF6（美國Abcam公司，Ab133462）、兔多抗myd88（美國Abcam公司，SC-109312）；HRP標記羊抗小鼠二抗（武漢博士德生物工程有限公司，BA1051）、HRP標記羊抗兔二抗（武漢博士德生物工程有限公司，BA1054）；ECL底物液（北京普利萊基因技術有限公司，P1050）。主要儀器：微型高速離心機，美國Labnet公司；電熱恒溫培養箱，日本ASONE公司；DYCZ-40電轉儀、DYCZ-24DN垂直電泳槽、DYY-7C電泳儀電源，北京六一儀器廠；全自動酶標儀，美國Thermo Fisher Scientific公司；402B超聲霧化機，江蘇魚躍醫療設備股份有限公司。

1.3 造模與分組 將4周齡大鼠適應性喂養3 d后，按體質量隨機分為4組，每組10只，分別為正常組、模型組、銀萊湯組、醋酸潑尼松組。

1.4 干預方法 模型組、銀萊湯組、醋酸潑尼松組每天早晚2次固定時間以LPS水溶液（0.5 mg∕mL）15 mL霧化吸入造模，每次30 min，連續3 d；正常組同樣的時間予以15 mL純水霧化吸入。每天早晚固定時間使用LPS霧化吸入建立肺炎模型后，銀萊湯組予5.6 g∕kg銀萊湯灌胃，醋酸潑尼松組予2.1 mg∕kg醋酸潑尼松溶液灌胃，共給藥3 d。3 d后大鼠禁食不禁水12 h，采用10%水合氯醛40 mL∕kg麻醉后進行后續操作，從腹主動脈采集血液，取肺組織。

1.5 標本采集與檢測 1）肺、胸腺臟器指數，腹主動脈取血后，取大鼠肺和胸腺，用0.9%氯化鈉溶液沖洗干燥。使用數字毫米秤稱重組織，計算臟器指數，公式如下：器官質量∕體質量×100%。2）大鼠切除肺臟稱重后，切取左肺一部分固定于10%甲醛溶液12 h，在石蠟包埋機中包埋后切成5 μm厚的切片，然后行常規蘇木精-伊紅（HE）染色。置于顯微鏡下觀察肺組織病理學變化，觀察肺泡上皮細胞的損傷程度和肺泡壁增厚程度。3）ELISA測定血清中炎癥因子水平，大鼠經腹主動脈取血后，3 000 r∕min 4℃離心10 min，取上清，按照ELISA試劑盒操作說明，檢測血清中TNF-α、IL-6、IL-1β炎癥因子的含量。4）Western blotting檢測大鼠肺組織蛋白表達水平，取大鼠的肺組織，液氮速凍后，-80℃保存備用。肺組織加入RIPA裂解液裂解勻漿，提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度，等量蛋白經過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入GAPDH（1∶1 000）、TLR4（1∶800）、MyD88（1∶800）、TRAF6（1∶2 000）、NF-κBp65（1∶1 000）、p-IKBα（1∶10 000）、IKBα（1∶1 000）一抗，4 ℃孵育過夜，TBST漂洗3次，每次10 min，室溫二抗孵育90 min，TBST漂洗3次，每次10min，ECL反應，采集圖像。采用Image J軟件分析灰度值以統計蛋白表達量。1.6 統計學處理 所有實驗數據保留兩位小數，應用SPSS26.0統計軟件。正態分布的數據以（±s）表示，以單因素方差分析進行組間差異比較。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠肺、胸腺臟器指數比較 見表1。與正常組相比，模型組、銀萊湯組、醋酸潑尼松組大鼠的肺臟器指數均有不同程度的升高（P＜0.01）。與正常組相比，模型組、銀萊湯組大鼠的胸腺臟器指數有下降趨勢，但無統計學意義（P＞0.05），醋酸潑尼松組大鼠的胸腺臟器指數呈現明顯下降（P＜0.01）。

表1 各組大鼠肺、胸腺臟器指數比較（%，±s）

表1 各組大鼠肺、胸腺臟器指數比較（%，±s）

注：與正常組比較，**P＜0.01。

組別正常組模型組銀萊湯組醋酸潑尼松組胸腺0.42±0.03 0.37±0.03 0.38±0.03 0.34±0.05**n 肺10 10 10 10 0.55±0.02 0.94±0.07**0.97±0.09**0.96±0.09**

2.2 各組大鼠肺組織病理變化 見圖1。HE染色結果顯示，正常組大鼠肺泡形態規則，結構清晰完整，基本正常，未見出血及炎性細胞浸潤。與正常組比較，模型組大鼠肺組織細胞膜破壞，肺泡結構雜亂，肺泡壁增厚，肺泡腔內可見大量炎性細胞及紅細胞。銀萊湯組和醋酸潑尼松組大鼠肺組織均出現不同程度的病變改善。

圖1 各組大鼠肺組織病理變化（HE染色，200倍）

2.3 各組大鼠血清中炎癥因子表達水平比較 見表2。與正常組比較，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β相對表達明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，銀萊湯組和醋酸潑尼松組大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β相對表達明顯降低（P＜0.01）。

表2 各組大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β表達水平比較（pg∕mL，±s）

表2 各組大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β表達水平比較（pg∕mL，±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05，△P＜0.01。下同。

組別正常組模型組銀萊湯組醋酸潑尼松組n 6 6 6 6 TNF-α 140.45±14.27 465.83±35.08**318.14±21.14△△273.44±31.58△△IL-6 87.31±5.92 248.27±14.10**161.69±15.64△△144.81±14.55△△IL-1β 107.05±15.36 348.00±31.09**231.65±20.90△△194.09±17.03△△

2.4 各組大鼠肺組織蛋白水平比較 見表3，圖2。與正常組比較，模型組大鼠肺組織TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κB p65、p-IKBα相對表達明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），IKBα相對表達明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。與模型組比較，銀萊湯組和醋酸潑尼松組大鼠肺組織中TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κB-p65、p-IKBα蛋白表達明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），IKBα相對表達明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）。

表3 各組大鼠肺組織中TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κBp65、p-IKBα、IKBα蛋白表達水平比較（±s）

表3 各組大鼠肺組織中TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κBp65、p-IKBα、IKBα蛋白表達水平比較（±s）

組別正常組模型組銀萊湯組醋酸潑尼松組n 3 3 3 3 TLR4 0.13±0.03 0.58±0.12**0.38±0.06△0.24±0.02△△MyD88 0.12±0.00 0.66±0.05**0.49±0.03△0.39±0.11△△TRAF6 0.14±0.03 0.64±0.06**0.43±0.03△△0.29±0.02△△NF-κB p65 0.24±0.08 0.82±0.08**0.56±0.07△△0.41±0.06△△p-IKBα 0.12±0.04 0.58±0.05**0.36±0.04△△0.25±0.05△△IKBα 0.54±0.04 0.11±0.01**0.27±0.07△0.35±0.06△△

圖2 各組大鼠肺組織TLR4、TRAF6、MyD88、NF-κB p65、p-IKBα、IKBα蛋白表達比較

3 討論

小兒肺炎的急性病程以肺熱證為主，在此階段及時進行干預是該病治療的關鍵。目前，在小兒肺炎肺熱證階段的治療以宣肺化痰為主，注重清熱解毒，治療病位主要在肺。銀萊湯是北京中醫藥大學谷曉紅教授的治療小兒肺炎的經驗方，以肺胃同治為主要治法[2]，由金銀花、萊菔子、連翹、黃芩、魚腥草、瓜蔞、前胡組成。回顧性病例系列研究發現，銀萊湯可明顯改善患兒機體狀態，治療效果總有效率可達95%，治愈率達85%[2-3]。研究表明，銀萊湯對發熱大鼠有明顯的抗炎退熱作用[4]，能通過調節免疫球蛋白和細胞因子的分泌來調節小鼠免疫功能，發揮其抗流感病毒的功效，達到治療食積復合流感病毒致小鼠肺部炎癥損傷的作用[5-7]。網絡藥理學分析顯示，銀萊湯可通過調控以TLRs、NF-κB、TNF等為主的信號通路來調節宿主免疫炎癥反應、血管生成和血管通透性、激素釋放和細胞生長、增殖和凋亡，來減輕肺部炎性癥狀[8-9]。

Toll樣受體是一類模式識別受體（PRRs），它通過識別外源性、內源性配體激活天然免疫[10]，其介導的信號通路在炎癥的發生發展中起重要作用[11]。在經典途徑中，TLR4的激活是從LPS與血清中LPS結合蛋白（LBP）相互作用開始的級聯事件[12]。TLR4∕NF-κB通路是近年來發現與抗炎免疫機制密切相關的信號通路，NF-κB的異常活化會引起炎性細胞因子的失控釋放，是導致肺損傷的重要機制[13]。NF-κB轉錄因子受多種上游信號分子的刺激而激活，TLR4是其中之一。LPS作為TLR4的典型配體，能被TLR4識別并以LPSCD14-MD-2復合物的形式激活細胞內的LPS-TLR4-MyD88-NF-κB 信號通路[14-15]。LPS刺激機體后，TLR4銜接蛋白MyD88募集IRAK4和IRAK1（或IRAK2）[16]；并激活腫瘤壞死因子受體相關因子6（TRAF6），使其發生低聚化[17]；活化的TRAF6募集并激活 TGF-β活化激酶 1（TAK1），TAK1結合蛋白1（TAB1）和TAK1結合蛋白2（TAB2）形成絡合物，該絡合物誘導激活IKKs復合物。NF-κB在靜息狀態下以三聚體形式的p50-p65-IκB存在于細胞質中[18]。IKKs復合物是IκB激酶，主要由兩個催化亞基IKKα、IKKβ和一個調節亞基IKKγ組成，是激活IκB的關鍵蛋白，也是NF-κB通路活化的主要啟動點[19]。p65、IκBα的磷酸化水平是證實NF-κB通路活化的重要檢測指標[20]。LPS可使IκB激酶激活致NF-κB磷酸化，IκB解離，NF-κB進入細胞核與DNA特定的κB序列結合后活化和核轉移，高效誘導促炎因子、黏附分子及趨化因子的基因轉錄[21]。其中誘導促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β的產生，促發更強的炎癥反應。

本研究結果顯示，LPS激活了幼齡大鼠肺組織的TLR4，使得TLR4信號通路上的MyD88、TRAF6蛋白增多，促進了IκBα磷酸化，致IκBα蛋白降低，p-IκBα蛋白數量增多，NF-κB磷酸化活化入核，促進促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平的增加，造成肺部炎癥，損傷肺組織結構。給予銀萊湯和醋酸潑尼松后，可減輕LPS引起的肺部炎癥和肺組織損傷，均可調控TLR4∕NF-κB信號通路上TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κB p65、p-IKBα、IKBα蛋白水平的表達，及降低血清炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平。另外，醋酸潑尼松雖能有效抗炎、抗過敏，降低毛細血管通透性，抑制結締組織增生，緩解炎癥癥狀，但該藥長期使用不良反應明顯，臨床應嚴格控制劑量及應用時間[22-23]。與醋酸潑尼松組的模型動物相比，銀萊湯組的胸腺指數變化不大，提示該方對機體有一定的保護作用。

綜上所述，本研究結果表明銀萊湯給藥對LPS誘導的幼齡大鼠肺炎模型具有較強的保護作用，其作用機制與減少肺部組織炎性病變、降低血清中炎癥因子水平以及下調TLR4∕NF-κB炎癥信號通路有關。