精氨酸聯合生物活性玻璃對乳牙釉質齲再礦化影響的研究

張 芮，貢 敏，祁建艷，周紅艷，劉 茜，王 玨，梅予鋒，3

齲病已經被證明是影響兒童最普遍的慢性病之一，影響著全球數百萬6歲以下的兒童[1]。目前，全球約有6.21億患有齲病的兒童未接受治療[2]。如此高的患病率和未治療率使得低齡兒童齲的預防和治療成為公共衛生服務的重點。氟化物被證明可以有效逆轉早期齲，促進再礦化的進程[3]。然而對于高齲風險者，氟化物的作用被證明是有限的[4]。因為氟化物在pH<4.5時作用效果有限，并且單純的氟仍然需要額外的鈣、磷等其他離子來協同再礦化。此外，氟化物的應用可能存在一定的氟牙癥、氟骨癥以及氟中毒[5-6]的風險，因此，6歲以下兒童不推薦使用含氟1 000 mg/kg以上的產品[4]。因此，不少學者把目光聚焦到其他材料上，希望通過使用更健康、更安全的材料來改善氟化物在防齲應用方面的局限性和潛在毒性。

近年來，生物活性玻璃(bioactive glass，BAG)由于其良好的生物相容性被廣泛應用于口腔眾多領域。與其他鈣磷基復合物不同，生物玻璃釋放的離子可以直接形成羥基碳酸鹽磷灰石層，沒有中間階段的無定型磷酸鈣(ACP)相[7]。我們課題組預實驗表明6%的生物活性玻璃可以有效再礦化乳牙釉質早期齲。然而其生成的礦化物鈣磷比低于正常釉質，提示其再礦化能力的局限。Bijle等發現2%的精氨酸(arginine，Arg)可以有效提高氟化鈉的再礦化釉質的效果。精氨酸作為產堿底物，可通過參與口腔內的產堿代謝，調高周圍環境pH[8]，被認為是一種很有前景的防齲策略[9]。目前罕見研究報道精氨酸聯合生物活性玻璃的再礦化效果。我們選擇乳牙為研究對象，利用體外pH循環法探究兩者聯用對乳牙早期釉質齲的再礦化效果，為安全有效地預防兒童齲病提供新思路。

1 材料與方法

1.1 樣本收集

該實驗獲得了南京醫科大學倫理委員會的批準(PJ2021-004-01)。2021年4月收集南京醫科大學附屬口腔醫院兒童口腔科60個拔除的乳切牙，要求牙冠完整，無齲壞、裂紋及釉質發育不全等。低速切割機截除牙根，將牙冠用環氧樹脂包埋，僅唇面暴露，用碳化硅紙(800,1 200,2 000目)拋光。將釉質面除開窗區(3 mm×3 mm)以外的部分用抗酸指甲油雙層封閉，超聲清洗5 min，在4 ℃冰箱保存。

1.2 溶液制備與分組

A組：6%BAG(大清生物，北京)溶液(n=10)；B組：6%BAG+1%Arg(麥克林，上海)溶液(n=10)；C組：6%BAG+2%Arg溶液(n=10)；D組：6%BAG+4%Arg溶液(n=10)；E組：去離子水(DDW)(n=10)；F組：正常組(n=5)；G組：脫礦組(n=5)

1.3 脫礦液及再礦化液的制備

脫礦液：2.2 mmol/L CaCl2、2.2 mmol/L KH2PO4和0.05 mol/L乙酸，調節pH為4.5。再礦化液：1.5 mmol/L CaCl2、0.9 mmol/L NaH2PO4和0.15 mol/L KCl，調節pH值為7.0。

1.4 早期釉質齲的制備

除正常組外，將其余55個樣本置于脫礦液中,37 ℃下浸泡48 h。脫礦完成后，超聲清洗5 min終止脫礦。

1.5 pH循環

分別在上午09:00和下午18:00進行兩次pH循環，共14 d。將樣本置于脫礦液10 min后用去離子水沖洗，使用微刷將各實驗組溶液均勻地涂布在釉質開窗面，涂布5 min。涂布完成后，流水下沖洗表面，擦干后置于再礦化液中，37 ℃培養箱中以模擬口腔環境。

1.6 再礦化后性能測試

1.6.1 表面顯微硬度 除正常組和脫礦組外，各實驗組每組分別隨機選取5個樣本，用維氏顯微硬度儀測量脫礦前后及再礦化后的顯微硬度值，分別記為VHN0、VHN1、VHN2。載荷為0.49 N, 作用時間為10 s，每個樣本測量5個點，取均值。硬度恢復率的定義如下：硬度恢復率(REMH) =(VHN2-VHN1)÷(VHN0-VHN1)×100%。

1.6.2 釉質表面微觀形貌及元素組成 正常組、脫礦組以及各個實驗組每組選取5個樣本，乙醇梯度脫水，室溫干燥，噴金，使用掃描電鏡觀察牙釉質表面形貌。每個樣本隨機選取3個區域進行能譜分析，以定量研究各組鈣、磷質量分數以及鈣/磷的原子比(Ca/P)。

1.7 統計學方法

用SPSS 25.0統計處理。硬度值及硬度恢復率使用單因素方差分析和圖基事后多重檢驗。鈣、磷質量分數，Ca/P使用Welch方差分析和Games-Howell檢驗兩兩比較，統計顯著性水平設為α= 0.05。

2 結 果

2.1 表面硬度

在基線(P=0.993)和脫礦48 h后(P=0.592)，各組間的硬度值無明顯差別。再礦化14 d后，精氨酸與生物活性玻璃聯用組的硬度值均顯著高于單獨應用組，其中C組硬度值最高。各組硬度恢復率均為正值，但各組間差異顯著(P<0.001)。各實驗組的硬度恢復程度均顯著高于DDW組。聯用組組間的硬度恢復率無明顯差異，均顯著高于A組，其中C組的硬度恢復率最高，為67.00%±2.03%，見表1。

表1 各組硬度值及硬度恢復率的均數±標準差

2.2 掃描電鏡結果

單一應用組及協同組均形成了新的片狀鈣化層，層層覆蓋，恢復了釉質表面的完整性。C組及D組釉質表面最為平坦，沉積物致密完整，未見明顯孔隙。去離子水組可見脫礦后暴露的釉質，部分區域形成了少許沉積物，沉積物較薄且分布不均，見圖1。

a：6%BAG；b：6%BAG+1%Arg；c：6%BAG+2%Arg；d：6%BAG+4%Arg；e:DDW組；f:正常組；g：脫礦組

2.3 元素分析結果

脫礦后鈣和磷含量均顯著降低。 pH循環后，各組鈣、磷含量均顯著增加,E組增加幅度最低。精氨酸聯用組的鈣、磷沉積量均顯著高于單獨應用組，其中D組鈣、磷含量最高。脫礦后鈣磷比降低為1.50±0.03，再礦化處理后，單獨應用生物活性玻璃組的鈣磷比升高，但與正常釉質的鈣磷比仍有差距。協同應用精氨酸后，鈣磷原子比顯著上升，且C組及D組的鈣磷比與正常釉質相似,見表2。

表2 鈣、磷元素的質量百分比和鈣磷原子比

3 討 論

顯微硬度已被證明是評估牙齒硬組織變化的有效方法之一，它可以提供釉質表面物理特性的信息[10]。顯微硬度的變化與牙齒結構中的礦物成分的變化相關[11]。乳牙釉質中的無機物含量低于恒牙釉質，因此乳牙釉質的表面硬度稍低于恒牙釉質。我們的研究顯示，正常乳牙釉質的表面顯微硬度為330.48±8.78至333.12±9.05，該數值與Molla Asadollah等[12]的研究結果一致。本研究中，pH循環結束后各組的表面硬度值均升高，表明各組均發生了一定程度的再礦化。添加精氨酸后，顯著提高了釉質表面性能的恢復能力，其中添加2%精氨酸的效果最佳。Yesilyurt等[11]也發現，精氨酸與碳酸鈣的產品可以顯著提高牙齒表面的硬度值，提出主要歸因于精氨酸作為堿性氨基酸，可以進一步提高牙齒周圍環境的pH值，從而較快達到促進鈣磷離子沉積的環境。

生物活性玻璃處理后的表面可以觀察到大量的納米微球，彼此連接成片狀，覆蓋病變表面。添加精氨酸后，孔隙繼續減少，提示可能吸附了更多的離子沉積，能譜分析結果進一步證明了這一點。與單獨應用生物活性玻璃相比，加入不同濃度的精氨酸后，鈣和磷離子的含量均有顯著提升，提示精氨酸具備更好的吸附鈣磷離子沉積的能力。精氨酸作為唾液黏蛋白的一種成分，能夠有效粘附在牙齒表面，進而調節離子間的動態平衡[13]。此外，精氨酸同時暴露羧基和氨基側鏈，靜電吸引周圍的鈣、磷離子。另一方面，精氨酸還可以通過化學鍵的作用形成高穩定系數的精氨酸-鈣-磷復合物[14]。

牙釉質的主要成分為羥基磷灰石，也可能存在雜質(如碳酸鹽)，這些雜質從一定程度上降低了鈣磷比[15]，本實驗收集的正常無齲壞的乳牙釉質表面的鈣磷比為1.60，低于理論值1.67。6%生物活性玻璃對病變表面成分的鈣磷比恢復有限，添加精氨酸后，顯著提高了釉質表面的鈣磷比，其中添加了2%及4%精氨酸后，鈣磷比與正常釉質無異。Tavafoghi等體外研究表明精氨酸有促羥基磷灰石(HA)成核的能力，可以誘導生成鈣磷比為1.80的礦化物[14]，與人體HA相似。鈣磷比越高，抗酸能力越強[16]。因此，將精氨酸加入生物活性玻璃中對乳牙齲病防治是有意義的。

我們的研究證明了精氨酸與生物活性玻璃對乳牙釉質早期齲有協同再礦化的效果。形成了鈣磷比接近于正常釉質的類羥基磷灰石的鈣化物，并恢復了表面硬度和形貌。其中添加了2%精氨酸的生物活性玻璃，綜合再礦化性能最佳。精氨酸作為一種營養物質，對兒童較為安全[17]，因此在乳牙早期齲的防治方面有著優越的前景。