東方蠑螈C-crk 基因的生物信息學分析

孫菲陽

（深圳北理莫斯科大學，廣東 深圳 518172）

近年來，蠑螈肢體再生機制研究是再生醫學研究的熱點，人們發現了大量生物分子參與肢體再生過程。隨著基于轉錄組學、蛋白質組學技術的進步，發現了大量與肢體再生相關的基因，闡明這些基因在肢體再生過程中的作用，將是肢體再生研究的重點。

信號接頭蛋白C-crk 參與了受體整合蛋白和酪氨酸激酶等多種分子的信號轉導，與腫瘤的發生、發展密切相關，在人體組織中不表達或少量表達，而在乳腺癌等惡性膠質瘤中的C-crk 在mRNA 與蛋白質水平均是高表達。然而目前對蠑螈C-crk 基因的研究十分匱乏，因此本研究擬對東方蠑螈C-crk 基因的基本生物學信息進行分析，為其在生物學等方面的功能提供理論依據。

1 文獻綜述

隨著現代科學的進步，人類在應對受傷的肢體中，從依賴假肢到嘗試新方法使肢體再生，并在此基礎上開拓了更專業的研究領域。研究發現，哺乳動物的肢體無法持續再生主要是因為在進化過程中已演變出優秀的人體免疫系統和愈合機制，細胞的再生與傷口愈合中都處于相互抵制狀態，但蠑螈卻具備強大的肢體再生能力。因此，深入地研究蠑螈肢體再生的作用機理，可為人類在再生醫學方面指點迷津，使斷肢再生成為可能。

C-crk 基因在癌細胞中過度表達，與癌癥進展密切相關。但C-crk 基因在肢體再生中是否存在重要作用仍然未知，阻礙了研究。因此，本文擬對東方蠑螈C-crk基因的基本生物學信息進行分析，為蠑螈C-crk 基因的進一步研究提供依據。

1.1 東方蠑螈概述

東方蠑螈 (Cynops orientalis)，也稱中國火龍，是國家級珍稀保護動物，屬于兩棲綱，蠑螈屬[1]。主要分布在我國的江蘇、浙江、湖北等省份，背部與兩側分別呈現淡黑色，腹部則為橙紅色，是有尾的兩棲類脊椎動物[2]。

蠑螈肢體再生研究進展：德國科學家發現在蠑螈體內有一種特殊酶能夠促進蠑螈肢體再生，科學家猜想，通過人為的合成這種酶，或許可幫助肢體傷殘及器官受傷的病人實現再生[3]。蠑螈的肢體結構與人類肢體非常相似，因此闡明蠑螈肢體再生的細胞機制對人類肢體再生具有重要意義。

目前研究揭示，在蠑螈斷肢前從肢體肘部游離肢體神經，結果斷肢后其肢體不能再生，這是由于阻止了傷口表皮與肢體神經的正常相互作用，從而導致肢體再生失敗，也表明肢體神經對蠑螈肢體成功再生至關重要[4]。另外一些研究也揭示，在斷肢后人為、機械的去除愈合的傷口表皮，則肢體再生失敗，可見傷口表皮對蠑螈肢體成功再生十分重要[5]。

1.2 C-crk 基因的概述

C-crk 是具有多功能的信號傳導接頭蛋白，是原癌基因 C-crk 編碼的產物[6]，crk 蛋白通過mRNA 的選擇性剪接，產生從結構上劃分的兩種蛋白質:v-crk 和 crk i；crkii 和crkl,高度同源的SH2 和SH3 結構域幾乎可以構成所有的C-crk 蛋白[7]。在信號分子傳遞的過程中，C-crk 蛋白本身并不具備酶活性，一般可與上下游的信號分子作用的是SH2、SH3 結構域，進行有序且特異性地信號傳導，參加腫瘤細胞的吸附、侵襲和增殖等信號的轉導[8]。

C-crk 基因在癌癥中的研究進展：C-crk 廣泛參與腫瘤細胞的遷移、生長、凋亡等。正常情況下，C-crk在人體中不表達或少量表達。而在乳腺癌、肺癌、卵巢癌等惡性的膠質瘤中C-crk 在mRNA 與蛋白質水平均是高表達[9]。

馮潤華等通過檢測368例胃癌患者癌組織中的C-crk表達水平發現，C-crk 在胃癌組織中表達明顯升高[10]。此外，李建芳等通過生物信息分析及熒光素酶報告系統發現miR-126 特異性靶向調控C-crk 表達參與胃癌的進展[11]。

朱進等研究發現，C-crk 蛋白在患者乳腺癌組織中表達程度明顯高于良性乳腺瘤組織[12]。李敏等發現miR-126 可通過超聲微泡介導來調節C-crk 表達抑制乳腺癌細胞生長，為乳腺癌的治療提供了新的措施[13]。李文燕等研究發現C-crk 在卵巢癌細胞高表達可能直接促進卵巢癌細胞的惡性增殖[14]。

2 實驗部分

基于前期的轉錄組測序數據，獲得了東方蠑螈Ccrk(coC-crk)的完整CDS 區cDNA 序列，本實驗擬對coC-crk 基因的核酸序列、編碼蛋白質的基本理化性質等進行分析。

2.1 實驗工具

如表1 所示。

表1 軟件的名稱及功能

2.2 實驗方法

1.基于前期轉錄組的測序結果，獲得coC-crk 基因的cDNA 序列。

2.coC-crk 基因的氨基酸序列及核苷酸序列分析：

打開DNAman 軟件，選擇“File”“new”，將cDNA 序列導入，點擊“Sequence”“load sequece”，選擇“From Selection”然后點擊“protein”，選擇“transl ation”，點擊選項“Frame1”。

3.coC-crk 基因編碼蛋白質結構域分析:

進入NCBI 網頁，選擇“Domains &Structures”，點擊“Conserved Domain Database (CDD)”，選擇“CD Search”。

4.coC-crk 基因編碼的氨基酸序列的基本理化性質分析：

打開 Protparam 網站，將氨基酸序列導入，選擇“Compute parameters”。

5.分析預測coC-crk 蛋白的二、三級結構：

打開SOPMA 網站，從Secondary structure prediction項目欄中選擇“SOPMA”，點擊“SUBMIT”。

打開Swiss-Model 網站，點擊“Start Modelling”，將氨基酸序列導入，點擊“Search For Templates”“Build Models”。

6.獲得不同物種C-crk 蛋白質的氨基酸序列：

打開NCBI 網站，選擇“Protein”，輸入C-crk、Search，點擊FASTA，選擇“Send to”，勾選“Show GI”，點擊“Create file”，下載不同物種的氨基酸序列。

7.coC-crk 蛋白與其他物種C-crk 蛋白質氨基酸序列比對分析：

打開DNAman 軟件，選擇“Sequence”“Alignment”，選擇“Multiple Sequence Alignment”，點擊“File”，選擇“Full Alignment”“Input”點擊“NO”，選擇“Run in background”和“show progress”，點擊“下一步”，選擇默認數值，完成操作。

3 實驗結果

3.1 coC-crk 基因序列分析

通過DNAman 軟件分析發現，coC-crk 完整CDS區基因大小為567 bp，編碼188 個氨基酸。

3.2 coC-crk 結構域分析

使用NCBI Conserved Domain 在線軟件分析，發現coC-crk 包含兩個結構域，分別是SH2 結構域（5-107氨基酸）和SH3 結構域（119-173 氨基酸）。

3.3 coC-crk 的理化性質分析

通過Protparam 分析發現，coC-crk 的分子量為215 09.99 Da，等電點為5.16。

3.4 coC-crk 二級及三級結構預測

分析發現，coC-crk 的β-折疊占6.38%，延伸鏈占19.68%，α-螺旋占 18.62%，55.32%為無規則卷曲。以2eyy.1A（同原性為81.72%）為模板，對coC-crk 進行同源建模，PyMOL Viewer 顯示coC-crk 蛋白質三級結構，結果如圖1 所示。

圖1 東方蠑螈C-crk 蛋白的三級結構預測

3.5 coC-crk 氨基酸序列比對

利用NCBI 下載不同物種的C-crk 序列，通過DNA man 軟件進行多序列比對。發現除Lepeophtheirus_salmonis 和Mytilus_coruscus 外，其余物種C-crk 的SH2結構域氨基酸序列高度保守，本次所選物種的c-crk 蛋白質序列SH3 結構域高度保守。

4 結論

C-crk 是細胞信號傳導的重要基因，研究發現在多種惡性腫瘤中C-crk 的mRNA 及其蛋白表達程度很高，表明其與腫瘤發展密切相關。本研究基于前期轉錄組測序結果獲得coC-crk 基因的CDS 區cDNA 序列，通過生物信息學軟件對其分析。

本研究采用多種軟件對coC-crk 基因CDS 區核酸序列、編碼蛋白質的基本理化性質、多序列比對進行分析，闡明了coC-crk 基因的基本生物學信息，為其生物學功能研究提供理論依據。