基于網(wǎng)絡(luò)藥理學方法和分子對接技術(shù)探討肝豆靈治療肝豆狀核變性認知障礙的作用機制

趙晨玲，董 婷，楊文明，江張勝，田麗偉

(安徽中醫(yī)藥大學1.研究生院，安徽 合肥 230038；2.第一附屬醫(yī)院,安徽 合肥 230031)

肝豆狀核變性(hepatolenticular degeneration，HLD)，即Wilson病(Wilson disease，WD)，是一種ATP7B基因缺陷所致的慢性進行性銅代謝障礙性疾病，全球平均患病率約為1/30 000，認知障礙是其主要的神經(jīng)癥狀[1]。目前現(xiàn)代醫(yī)學在治療WD認知障礙方面尚無特效方法，一般用藥包括銅螯合劑和腦細胞活化劑等，此類藥物雖可在一定程度上緩解患者的相關(guān)癥狀，但存在副作用大、療效欠佳等問題，從而限制了其臨床應(yīng)用[2]。中藥復方因其副作用小，且具有多成分、多靶點、多通路的特點，近年來逐漸成為WD認知障礙防治的研究熱點。

肝豆靈是安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院所創(chuàng)制的具有自主知識產(chǎn)權(quán)的院內(nèi)制劑，由丹參、莪術(shù)、姜黃、雞血藤、黃連、生大黃六味中藥組成[3]。該方重用姜黃、黃連為君，活血行氣、化痰燥濕，取“治痰先治氣，氣順痰自消”之意；以丹參、莪術(shù)、雞血藤為臣，活血化瘀，軟堅散結(jié)，通經(jīng)活絡(luò)以祛銅濁毒邪外出；佐以大黃通腑利濕、排銅解毒。諸藥合用，共奏行氣活血、化痰祛瘀、排銅解毒之功。臨床研究表明，肝豆靈可顯著改善WD引起的認知障礙[4]，但其作用機制尚待明確。

近年來，網(wǎng)絡(luò)藥理學的興起為中藥復方的作用機制研究提供了新的方向[5]，其可通過構(gòu)建中藥復方與疾病間的“化學成分-交集靶點”多向性網(wǎng)絡(luò)，進而從分子層面揭示兩者之間的關(guān)聯(lián)作用。基于此，本研究依托網(wǎng)絡(luò)藥理學方法及分子對接技術(shù)，旨在探討肝豆靈治療WD認知障礙的作用機制，以期為今后肝豆靈的實驗研究及臨床應(yīng)用提供新的理論支撐。

1 方法

1.1 肝豆靈化學成分篩選及潛在靶點預(yù)測通過TCMSP(https://tcmspw.com/tcmsp.php)數(shù)據(jù)庫，分別以肝豆靈中各單味中藥的名稱(丹參、莪術(shù)、姜黃、雞血藤、黃連、生大黃)為關(guān)鍵詞進行檢索，其中生大黃按大黃進行檢索，以口服生物利用度(OB)≥30%，類藥性(DL)≥0.18為過濾條件，篩選出肝豆靈中各單味中藥的有效化學成分及其相對應(yīng)的潛在靶點，并利用Uniprot(https://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫，將所獲靶點名稱轉(zhuǎn)換成標準基因名，從而得到肝豆靈的基因靶點。

1.2 疾病相關(guān)靶點獲取通過GeneCards(https://www.genecards.org/)、OMIM(https://omim.org/)、PharmGkb(https://www.pharmgkb.org/)、TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)數(shù)據(jù)庫，以“cognitive impairment in Wilson disease”為關(guān)鍵詞，檢索與WD認知障礙相關(guān)的作用靶點，并將所獲靶點進行合并去重。

1.3 交集靶點篩選及“化學成分-交集靶點”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將肝豆靈的基因靶點和WD認知障礙的疾病靶點上傳至Veen在線作圖工具(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)進行Veen分析后，得到其交集靶點名稱。利用Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建肝豆靈與WD認知障礙間的“化學成分-交集靶點”多向性網(wǎng)絡(luò)圖并篩選出其核心節(jié)點。

1.4 蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點篩選將肝豆靈與WD認知障礙的交集靶點導入到String(https://www.string-db.org/)數(shù)據(jù)庫中進行PPI分析，限定物種為Homo Sapiens，設(shè)置最低置信度為0.9，同時隱藏游離的點，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，下載對應(yīng)的tsv文件并將其導入到Cytoscape 3.8.0軟件中，應(yīng)用CytoNCA插件計算各節(jié)點的BC、CC、DC、EC、LAC及NC值，對結(jié)果進行拓撲分析后得到關(guān)聯(lián)度最大的靶點，即為核心靶點。

1.5 基因本體(GO)生物功能和基因組百科全書(KEGG)通路富集分析借助DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)數(shù)據(jù)庫進行GO生物功能和KEGG通路富集分析(選取條件為P<0.05)，并利用R 4.0.3軟件所獲結(jié)果進行可視化處理，繪制條形圖及氣泡圖，以期從生物功能和信號通路的角度分析肝豆靈治療WD認知障礙可能的作用機制。

1.6 分子對接將度值排名前3的核心靶點與其對應(yīng)的化學成分進行分子對接。利用PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載化學成分的小分子配體文件，將其導入到Chem3D軟件中進行空間結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化及能量優(yōu)化后，輸出為mol2格式文件，再經(jīng)AutoDockTools 1.5.6軟件處理后將文件保存為pdbqt格式。從Uniprot數(shù)據(jù)庫檢索核心靶點的基因ID，并在PDB數(shù)據(jù)庫(http://www1.rcsb.org/)下載其所對應(yīng)的PDB格式文件，經(jīng)Pymol軟件進行水分子去除及受配體分離后，將所獲核心靶點的大分子受體文件導入到AutoDockTools 1.5.6軟件進行加氫處理并以pdbqt格式進行文件保存。借助Autodock vina 1.1.2軟件將核心靶點及其對應(yīng)的化學成分進行分子對接，并以結(jié)合能作為對接評價指標。

2 結(jié)果

2.1 肝豆靈化學成分篩選及潛在靶點預(yù)測結(jié)果通過TCMSP數(shù)據(jù)庫共收集得到肝豆靈的化學成分146個，其中丹參65個，莪術(shù)3個，姜黃24個，雞血藤24個，黃連14個、大黃16個，化學成分-潛在靶點一一對應(yīng)后得到肝豆靈的有效化學成分118個(Tab 1列出OB值排名前20位的有效化學成分)，對應(yīng)潛在靶點254個，利用Uniprot數(shù)據(jù)庫將所獲靶點名稱轉(zhuǎn)換成標準基因名，合并去重后共得到肝豆靈的基因靶點218個。

2.2 疾病相關(guān)靶點篩選結(jié)果通過GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD數(shù)據(jù)庫，以“cognitive impairment in Wilson disease”為關(guān)鍵詞進行檢索，將所獲靶點進行合并去重后，得到與WD認知障礙相關(guān)的作用靶點4 858個(Fig 1)。

Fig 1 Target map of cognitive impairment in WD

2.3 交集靶點篩選及“化學成分-交集靶點”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果將218個肝豆靈的基因靶點和4 858個WD認知障礙的疾病靶點上傳至Veen在線作圖工具(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)進行Veen分析后，共得到交集靶點189個(Fig 2)。利用Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建肝豆靈與WD認知障礙間的“化學成分-交集靶點”多向性網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果顯示，網(wǎng)絡(luò)共包含284個節(jié)點及1 221條邊，其中肝豆靈化學成分節(jié)點95個，交集靶點節(jié)點189個。以大于節(jié)點度值中位數(shù)的2倍作為篩選條件，得出槲皮素(quercetin)、木犀草素(luteolin)、丹參酮ⅡA(tanshinone iia)為度值排名前3的化學成分，其度值依次為108、50、37，這些化學成分可能在肝豆靈治療WD認知障礙中起著關(guān)鍵作用。

Fig 2 Veen map of Gandouling and cognitive impairment in WD

Tab 1 Prediction results of effective chemical components of Gandouling (Top 20 in OB value)

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點篩選結(jié)果將189個肝豆靈與WD認知障礙的交集靶點導入到String數(shù)據(jù)庫中進行PPI分析，限定物種為Homo Sapiens，設(shè)置最低置信度為0.9，同時隱藏游離的點，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果顯示，網(wǎng)絡(luò)共包含188個節(jié)點及790條邊，平均節(jié)點度值為8.4。下載對應(yīng)的tsv文件并將其導入到Cytoscape 3.8.0軟件中，應(yīng)用CytoNCA插件計算各節(jié)點的BC、CC、DC、EC、LAC及NC值，并對結(jié)果進行拓撲分析后，最終得到關(guān)聯(lián)度最大的前14個靶點，依次為JUN、STAT3、TP53、MAPK1、MAPK14、MYC、IL6、TNF、RB1、CCND1、AKT1、EGFR、RELA、CXCL8(Fig 3)，這些靶點可能是肝豆靈治療WD認知障礙的核心靶點。其中，JUN、STAT3、TP53為度值排名前3的靶點。

Fig 3 Core target network of Gandouling in treatmentof cognitive impairment in WD

2.5 GO生物功能富集和KEGG通路富集分析結(jié)果借助DAVID數(shù)據(jù)庫進行GO生物功能富集，結(jié)果得到GO條目2 922個，其中生物過程(BP)條目2 555個，細胞組成(CC)條目122個，分子功能(MF)條目245個(選取條件為P<0.05)。由于P值代表富集顯著性，故選取BP、CC、MF中P值最小的前10個條目，利用R 4.0.3軟件制作成GO生物功能富集條形圖及氣泡圖(Fig 4、Fig 5)。結(jié)果顯示，肝豆靈與WD認知障礙交集靶點基因的BP主要集中在藥物反應(yīng)(response to drug)、金屬離子反應(yīng)(response to metal ion)、氧化應(yīng)激反應(yīng)(response to oxidative stress)等；CC主要集中在膜筏(membrane raft)、膜微區(qū)(membrane microdomain)、膜區(qū)(membrane region)等；MF主要集中在DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(DNA-binding transcription factor binding)、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(RNA polymerase Ⅱ-specific DNA-binding transcription factor binding)、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合(ubiquitin-like protein ligase binding)等。

Fig 4 Go biological function enrichment bar chart of Gandoulingin treatment of cognitive impairment in WD

Fig 5 Go biological function enrichment bubble chartof Gandouling in treatment of cognitive impairment in WD

借助DAVID數(shù)據(jù)庫進行KEGG通路富集分析，結(jié)果得到KEGG信號通路175條。由于P值代表富集顯著性，故選取P值最小的前30條信號通路，利用R 4.0.3軟件制作成KEGG信號通路富集條形圖及氣泡圖(Fig 6、Fig 7)。結(jié)果顯示，肝豆靈與WD認知障礙交集靶點基因的信號通路主要涉及PI3K-AKT信號通路(PI3K-AKT signaling pathway)、AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway)、脂質(zhì)與動脈粥樣硬化信號通路(lipid and atherosclerosis)等。

2.6 分子對接結(jié)果將“2.4”項中度值排名前3的核心靶點與其對應(yīng)的化學成分進行分子對接(見Tab 2)。結(jié)果顯示，核心靶點與其對應(yīng)的化學成分之間均有較強的相互作用，其中JUN與槲皮素的結(jié)合性最好，運用Pymol軟件對其進行可視化分析(Fig 8)。從Fig 8可以看出，JUN主要通過Arg263、Asn262兩個氨基酸殘基與槲皮素發(fā)生H鍵作用，氫鍵的結(jié)合能為-9.2 kcal·mol-1。

Fig 6 KEGG signal pathway enrichment bar chart of Gandoulingin treatment of cognitive impairment in WD

Fig 7 KEGG signal pathway of Gandouling in treatmentof cognitive impairment in WD

Fig 8 2D map of interaction between Jun and QuercetinTab 2 Virtual docking results of core target-chemical components of Gandouling in treatment of cognitive impairment in WD

Core targetPDB IDChemical compositionBinding energy/kcal·mol-1JUN5T01rhein -9.0JUN5T01beta-sitosterol-1.7JUN5T01luteolin-8.9JUN5T01tanshinone iia-8.8JUN5T01quercetin-9.2JUN5T01formononetin-8.6STAT36NUQcryptotanshinone-8.8STAT36NUQlicochalcone a-7.9TP53 7BWNaloe-emodin-8.4TP53 7BWNluteolin-8.6TP53 7BWNtanshinone iia-8.3TP53 7BWNquercetin-9.1

3 討論

WD認知障礙雖在中醫(yī)典籍中并無相對應(yīng)的病名記載，但依據(jù)其臨床表現(xiàn)，一般可將其歸屬于“健忘”“善忘”“呆病”等范疇。中醫(yī)認為，痰瘀互結(jié)是本病最主要的證候特征，其發(fā)病機制為“銅毒內(nèi)蘊，痰瘀阻絡(luò)”。肝豆靈作為化痰祛瘀法的典型院內(nèi)制劑，經(jīng)臨床研究證實，其對清除WD患者腦部沉積銅有積極作用，可有效改善其神經(jīng)病變[6]；同時,動物實驗亦表明，肝豆靈可降低WD模型TX小鼠神經(jīng)細胞中活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)水平[7]，并可阻止炎癥小體激活，具有抑制神經(jīng)細胞凋亡，改善認知障礙的作用[4]。

本研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素、木犀草素、丹參酮ⅡA等化學成分是與WD認知障礙相關(guān)靶點作用最多的化學成分，提示其可能與肝豆靈治療WD認知障礙密切相關(guān)。有文獻報道，槲皮素、木犀草素、丹參酮ⅡA均可通過抗炎、抗氧化、抗凋亡等多種途徑來發(fā)揮其神經(jīng)保護的效用[8-10]。槲皮素可減緩認知障礙細胞模型和動物模型的病理進程[11-12]，其作用機制可能與抑制海馬TLR4/NF-κB信號通路，阻斷炎癥因子參與的“級聯(lián)事件”及增加AKT信號通路中AKT蛋白磷酸化的程度，減輕海馬神經(jīng)細胞凋亡有關(guān)[8,13]。木犀草素可通過調(diào)節(jié)機體的抗氧化系統(tǒng)，降低ROS水平，減輕炎癥反應(yīng)，增強突觸傳遞，減少認知障礙大鼠在Morris水迷宮試驗中的逃避潛伏期，改善記憶能力，提高認知功能[9]。丹參酮ⅡA可降低海馬組織中Tau蛋白過度磷酸化及β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)過度沉積，并可通過激活PI3K-AKT信號通路，抑制神經(jīng)細胞凋亡，促進神經(jīng)細胞的修復和再生[14]。

PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，JUN、STAT3、TP53為PPI網(wǎng)絡(luò)中度值排名前3的靶點，提示其可能是肝豆靈治療WD認知障礙的核心靶點。研究表明，JUN、STAT3及TP53均具有誘導神經(jīng)細胞凋亡的作用，其機制可能與Tau蛋白的過度磷酸化、Aβ的過度激活及炎癥因子的介導有關(guān)。目前，對于肝豆靈治療WD認知障礙的實驗研究多集中在測定IL-1β、IL-6和TNF-α等炎癥因子的表達上，而對于JUN、STAT3、TP53改善WD認知障礙，發(fā)揮神經(jīng)保護的作用機制臨床卻鮮有報道，故需進一步實驗驗證。

結(jié)合GO生物功能富集結(jié)果及相關(guān)文獻可知，大量銅離子蓄積于腦，可提高腦組織中ROS水平，引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)[7]。氧化應(yīng)激信號匯集到下游，可促使caspase-3活化并對AKT進行剪切，抑制PI3K-AKT信號通路傳導，導致Tau蛋白過度磷酸化及Aβ過度沉積，同時激活相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活性，誘導神經(jīng)細胞凋亡，進而影響認知功能[15]。KEGG通路富集結(jié)果顯示，肝豆靈治療WD認知障礙的核心通路主要涉及PI3K-AKT、AGE-RAGE信號通路等。PI3K-AKT信號通路可通過誘導細胞自噬，促進海馬神經(jīng)細胞內(nèi)Aβ的清除及Tau蛋白的去磷酸化，減輕神經(jīng)突觸損傷，增強神經(jīng)突觸形態(tài)，抑制海馬神經(jīng)細胞凋亡，改善學習記憶能力[15]；AGE-RAGE信號通路可通過觸發(fā)機體氧化應(yīng)激及神經(jīng)炎癥反應(yīng)[16-17],促使海馬神經(jīng)細胞凋亡，導致認知功能損害[18]。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學方法和分子對接技術(shù)，探討了肝豆靈治療WD認知障礙的作用機制，發(fā)現(xiàn)肝豆靈的主要化學成分槲皮素、木犀草素、丹參酮ⅡA等可能作用于JUN、STAT3、TP53等核心靶點，并通過PI3K-AKT、AGE-RAGE等信號通路來降低ROS水平，減輕炎癥反應(yīng)，抑制神經(jīng)細胞凋亡，發(fā)揮其保護神經(jīng)細胞、改善認知功能的效用，表現(xiàn)出多成分、多靶點、多通路的作用特點，為今后的實驗研究及臨床應(yīng)用提供了新的理論支撐。