基于網絡藥理學探討隱丹參酮抗非小細胞肺癌的作用機制

湯 姝，吳占申，李 納，溫 強，康 建，張曉堅

(鄭州大學1.第一附屬醫院藥學部，河南 鄭州 450052；2.臨床藥理研究所，河南 鄭州 450001)

肺癌(lung cancer)目前是世界上最為常見的惡性腫瘤之一，大約有四分之一的癌癥相關死亡都歸因于肺癌[1]。非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)約占所有肺癌的80%，是世界范圍內發病率和死亡率最高的惡性腫瘤。盡管手術方案的改進和靶向藥物的開發極大改善了NSCLC的治療現狀，但是約75%的患者發現時已處于中晚期，其5年生存率很低。

隱丹參酮(cryptotanshinone，CTS)為二萜類單體，是從傳統唇形科中草藥丹參(Salvia miltiorrhiza)干燥根和根莖中提取出的一種脂溶性成分。CTS已被證實具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌和抗炎多種生物活性。近年來[2]，其在抗腫瘤方面的藥理活性得到許多研究者的關注。CTS可以通過抑制腫瘤細胞遷移與侵襲、誘導腫瘤細胞凋亡、抑制新血管的生成、抑制腫瘤細胞增殖、調控雌雄激素受體信號和抑制淋巴管生成等機制來發揮其抗腫瘤活性[3]。CTS的化學結構如Fig 1所示。

Fig 1 The chemical structure of cryptotanshinone

已有研究證明CTS可以通過促進NSCLC癌干細胞中河馬信號通路調節因子TAZ的核質轉位而降低其表達[4]。許冠華等[5]的研究表明,CTS抑制PC9細胞生長的作用機制可能是通過抑制STAT3的 Tyr705和Ser727的磷酸化表達水平。馬蒙恩等[6]的研究表明，CTS可以下調p-ERK1/2、MMP-2和MMP-9的表達從而降低PC9細胞的遷移侵襲能力。目前關于CTS抗NSCLC相關機制的研究仍比較少，也并不全面。

本研究欲利用網絡藥理學以及生物信息學方法來構建“CTS-交集靶點-KEGG通路”網絡圖，進一步探討CTS抗NSCLC的機制，并為其進一步的深入研究奠定理論基礎。本研究的流程圖如Fig 2所示。

1 材料與方法

1.1 CTS相關靶點的獲得使用TCMSP數據庫(https://old.tcmsp-e.com/)檢索cryptotanshinone，獲CTS相關作用靶點。為了更全面的收集CTS相關的可靠靶點，通過PharmMapper數據庫(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)進行靶點預測，根據Normalized Fit Score>0.8進行靶點的篩選。然后通過SwissTargetPrediction靶點預測平臺(http://www.swisstargetprediction.ch/)對CTS的作用靶點進行預測，并根據Probability>0進行靶點篩選。通過Uniprot數據庫(https://www.uniprot.org/)將靶點名字轉換為統一的基因名，并限定物種為人類。

Fig 2 Flow chart

1.2 NSCLC相關靶點的獲得通過GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/)和OMIM數據庫(https://omim.org/)檢索non-small cell lung cancer和其同義詞non-small cell lung carcinoma，并通過TCGA數據庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)下載LUAD(Lung adenocarcinoma)以及LUSC(Lung squamous cell carcinoma)轉錄組數據中的Htseq -Counts。并用R語言的limma包進行差異表達基因分析，設置P<0.05以及|log2FoldChange|>2。將結果進行整合后刪除重復基因。

1.3 CTS和NSCLC交集靶點將CTS相關靶點和NSCLC相關靶點取交集后得到75個交集靶點。

1.4 蛋白相互作用網絡圖構建(PPI)上述所得到的交集靶點導入到String數據庫(https://string-db.org/)，限定物種為人。本研究采取高可信度，即minimum required interaction score選擇high confidence(0.700)來構建PPI網絡圖。結果保存為TSV文件導入到Cytoscape_3.8.2，根據Degree和Combined-score值重新繪制PPI網絡圖。并對PPI網絡圖進行網絡拓撲學分析，以篩選核心靶點(hub targets)。

1.5 分子對接用AutoDockVina 1.1.2軟件將核心靶點與CTS進行分子對接實驗，并用NSCLC臨床常用藥物吉西他濱(Gemcitabine)作為對照組[7]。PDB(Protein Data Bank)數據庫(http://www1.rcsb.org/)下載核心靶點的蛋白質的pdb文件，用Pymol 2.4去除蛋白質分子的配體。從PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載CTS和吉西他濱的sdf文件，并轉換為pdb格式文件。使用AutoDockTools 1.5.6對蛋白質分子和配體的pdb文件進行除水、加氫、加電荷等操作。使用AutoDock Vina 1.1.2對蛋白質和配體進行分子對接，并對對接結果進行進一步的分析。

1.6 GO和KEGG通路富集分析使用R語言的clusterProfiler包對交集靶點進行GO富集分析和KEGG通路富集分析。GO富集分析分為生物過程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)和細胞組分(cellular component，CC)三部分。R語言代碼設置pvalueCutoff=0.01和qvalueCutoff=0.01，GO分別取P值最小的前十項、KEGG取前二十項進行數據可視化分析。

1.7 “CTS-交集靶點-KEGG通路”網絡圖構建通過Excel構建CTS、交集靶點和前二十條KEGG通路的對應關系，后導入到Cytoscape_3.8.2軟件，構建“CTS-交集靶點-KEGG通路”網絡圖。

2 結果

2.1 交集靶點的獲得TCMSP數據庫共檢索出30個CTS相關靶點，少數未經DrugBank數據庫驗證。PharmMapper數據庫經過篩選后共得到22個靶點，SwissTargetPrediction數據庫篩選后共得到56個靶點。3個數據庫得到的靶點整合并刪除重復值后共得到97個靶點。通過對OMIM、GeneCards以及TCGA數據庫分析共得到NSCLC相關靶點7 376個。對CTS和NSCLC相關靶點取交集，得到75個交集靶點，見Fig 3。

Fig 3 Intersection targets

2.2 PPI網絡圖交集靶點通過String數據庫以及Cytoscape軟件得到的PPI網絡圖結果如Fig 4所示。如PPI網絡圖所示，節點(nodes)為交集靶點，邊(edges)表示的是靶點與靶點之間的關聯關系，其中共有66個節點，226條邊。節點越大則度值(degree)越大，邊越粗則連接評分(combined-score)越高。對PPI網絡圖相關數據進行分析，平均度值為6.84，平均節點緊密度(closeness centrality)為0.39，平均節點介度(betweenness centrality)為0.03。經過篩選，靶點相對應的度值、節點緊密度、節點介度均大于平均度值、平均節點緊密度、平均節點介度的共有12個。此12個靶點有較大可能為CTS抗NSCLC作用的核心靶點。通過DisGeNET數據庫檢索12個靶點，初步得到靶點相對應的蛋白類別，按照度值大小排序得到Tab 1。

Fig 4 PPI network

Tab 1 Hub targets related information

2.3 分子對接根據Tab 1選取度值大于或等于20的靶點，即STAT3、APP、MAPK1和PIK3CA，與CTS和吉西他濱(Gemcitabine)分別進行分子對接，結果如Tab 2所示。通常情況下認為結合能小于0，則蛋白質與受體可以自發的結合，同時結合能越低則發生結合的可能性越大。分子對接驗證結果顯示選取的核心靶點均可與CTS自發的結合，且與吉西他濱相比，CTS與靶點的結合能均更小，表明CTS與靶點的結合力更大。CTS與四個靶點的理論上最佳結合位置圖結果如Fig 5。

Tab 2 Molecular docking results of CTS and Gemcitabine

2.4 GO和KEGG通路富集分析

2.4.1GO富集分析 R語言clusterProfiler包對交集靶點進行GO富集分析，得到BP條目564個、CC條目22個和MF條目34個。分別只顯示P值由小到大排列的前十項，可視化分析結果如Figure 6-8所示。顏色越紅表示該條目富集越顯著，圓形越大表示該條目富集的基因越多，連線越粗則表示條目與條目之間的關系越密切。由圖形可知，CC主要涉及膜微區、膜筏以及突觸前后膜等。MF主要涉及G蛋白偶聯的胺受體活性、磷酸酯水解酶活性、蛋白質酪氨酸磷酸酶活性、乙酰膽堿受體活性等方面。BP主要涉及ERK1和ERK2級聯反應以及反應的調節、與環狀核苷酸第二信使偶聯的G蛋白偶聯受體信號轉導途徑、血管直徑的調節、磷脂酶C激活的G蛋白偶聯受體信號通路、腺苷酸環化酶調節性G蛋白偶聯受體信號通路和化學突觸傳遞的調節等方面。由Figure 8可見，ERK1和ERK2級聯反應的相關通路通過化學突觸傳遞的調節與其他通路相聯系。

Fig 6 CC enrichment analysis

2.4.2KEGG富集分析 KEGG通路富集分析共得到35條通路，選取P值最小的前20條進行高級氣泡圖的繪制，得到結果如Fig 9所示。表明CTS抗NSCLC主要涉及信號轉導、免疫系統、疾病通路和細胞凋亡等多個復雜的生物學過程。信號轉導通路有神經活性配體-受體相互作用、鈣離子信號通路、Jak-STAT信號通路等，免疫系統包括NOD樣受體信號通路和自然殺傷細胞介導的細胞毒性等通路，疾病通路包括胰腺癌、大腸癌途徑、急性粒細胞白血病、慢性粒細胞白血病等通路，以及細胞凋亡通路。前10條通路之間的相互關系圖如Fig 10，可見神經活性配體-受體相互作用和鈣離子信號通路相對獨立于其他通路之外。

Fig 7 MF enrichment analysis

Fig 8 BP enrichment analysis

Fig 9 KEGG enrichment bubble chart

Fig 10 KEGG enrichment emapplot

2.5 “CTS-交集靶點-KEGG通路”網絡圖構建通過Cytoscape_3.8.2軟件構建“CTS-交集靶點-KEGG通路”網絡圖如Fig 11所示。該網絡包括96個節點(其中1個化合物、75個靶點以及20條KEGG通路)以及232條邊。網絡拓撲學分析得靶點的度值、節點緊密度和節點介度均高于其對應平均值的靶點有12個。KEGG通路的度值、節點緊密度和節點介度均高于其對應平均值的通路有2條。按照度值排序結果見Tab 3。靶點PIK3CA、MAPK1和STAT3很好的和PPI網絡圖形成了對應關系，但是APP靶點并未有較高的度值，初步推測酶調節劑APP可能是通過調節其他蛋白的活性來間接發揮其抗NSCLC的作用。

3 討論

本研究運用網絡藥理學和生物信息學相結合的方法對CTS抗NSCLC的分子機制進行了較為全面的探討。

Tab 3 Correlation degree of targets and pathways

“CTS-交集靶點-KEGG通路”網絡圖表明了CTS抗NSCLC是多靶點、多通路機制。STAT3、APP、MAPK1和PIK3CA極大可能是CTS抗NSCLC的核心靶點。STAT3為一種信號轉錄蛋白，其組成性異常激活與細胞的增殖、分化、癌變密切相關，并在肺癌等腫瘤干細胞中存在異常的表達[8]。

APP是淀粉樣β前體蛋白，研究表明淀粉樣β前體蛋白結合家族成員1(APBB1)可以通過激活IGF1R信號通路，促進NSCLC上皮間質轉化[9]。本課題組之前的研究發現CTS可以減少β-AP(APP水解而來)的合成以及β-AP的沉積速率[10]。關于APP和NSCLC之間的研究很少，值得我們進一步的研究。

MAPK1(ERK2)是細胞內的絲/蘇氨酸蛋白激酶，其在肺癌患者中高表達。李耀杰等[11]則通過實驗驗證了miR-105-5p靶向下調MAPK1的表達抑制A549細胞的生長、運動和上皮間質轉化。MAPK1有望成為治療NSCLC的潛在性靶點。

PIK3CA為NSCLC相關驅動基因，嚴曉娣等[12]運用高通量測序技術檢測了NSCLC患者相關基因的突變情況，PIK3CA突變的檢出率為4.67%。宋忠花等[13]發現PIK3CA基因沉默48 h后，A549細胞的轉移和侵襲能力顯著降低。NSCLC組織中miR-363-3p可以通過靶向下調PIK3CA抑制A549細胞的增殖、侵襲和遷移[14]。PIK3CA亦有望成為治療NSCLC的潛在性靶點。

分子對接結果表明了CTS相較于臨床藥物吉西他濱與核心靶點有更好的親和力。CTS為脂溶性成分，結果提示我們可以對CTS的結構進行進一步的改造，以提高其水溶性，CTS或許可以成為抗NSCLC聯合用藥的一種選擇。

GO富集分析結果表明CTS抗NSCLC機制的復雜性，廣泛涉及信號傳導、磷酸化與去磷酸化、細胞凋亡與血管調節等多種生物過程。

KEGG富集分析結果表明CTS抗NSCLC主要涉及信號傳導、免疫系統等相關通路。CTS作為STAT3抑制劑，可以作用于STAT3相關信號通路來發揮其抗腫瘤的作用。根據相關靶點在通路中的位置分析，其機制與TYK2/STAT3通路相關的Bcl-XL、PIM1介導的抗細胞凋亡以及CyclinD1相關的細胞增殖有關。并且和SHP1/SHP2、PI3K/AKT、NF-κB、TNF-α(腫瘤壞死因子α)、MAPK級聯反應和TGF-β(轉化生長因子β)信號通路有關。

已有研究證明CTS可以通過JAK2/STAT3、SHP1/SHP2通路來發揮其抗慢性粒細胞白血病的作用，可以增強TNF-α誘導的KBM-5細胞凋亡[15-16]。提示我們CTS可能通過SHP1/SHP2和TNF-α通路發揮其抗NSCLC的作用。NF-κB 途徑可以介導CyclinD1、Bcl-XL以及COX-2(PTGS2)的表達，Cao等[17]研究發現，CTS 劑量依賴性地抑制人腸道細胞中mRNA和蛋白水平COX-2的表達，從而降低PGE2表達量。COX-2在免疫系統以及腫瘤血管生成等方面發揮著重要作用，我們初步推測CTS可能是COX-2的抑制劑從而抑制腫瘤血管的生成。張倩鈺等[18]驗證了CTS能抑制TGF-β誘導的A549細胞由鋪路石向梭狀的形態轉變，并降低了誘導之后的α-SMA表達量。CTS可能是通過競爭性結合SMAD4，從而減少了SMAD2/3與SMAD4的結合量來降低α-SMA的表達量。CTS能否通過TYK2/STAT3、SHP1/SHP2通路以及其他待驗證通路發揮其抗NSCLC作用，仍需要進一步的實驗驗證。

綜上所述，本研究以CTS為對象，運用網絡藥理學以及生物信息學方法，對CTS抗NSCLC的潛在相關性靶點以及機制進行了較為全面的探討。為抗NSCLC的藥物治療提供了一定的參考價值，也為將CTS進一步開發為生物活性更高的抗NSCLC藥物提供了理論上的支持。