丹皮酚通過雌激素受體α調控巨噬細胞表型轉換

連娜琦，朱子涵，殷凡章，李文文，周喆聿，王中揚，吳 祥，李 育，卞慧敏

(南京中醫藥大學 1. 醫學院·整合醫學學院，2. 藥學院，江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室，江蘇 南京 210023)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種由脂質代謝紊亂等多種因素引起的血管炎性病變。流行病學研究發現圍絕經期女性由于卵巢功能衰竭，體內雌激素水平降低，導致患AS的風險急劇增加[1]。雌激素通過雌激素受體(estrogen receptor，ER)發揮其生物學效應，其主要分為ERα、ERβ兩個亞型；研究表明ERα表達下降會促進AS的發生[2]。在AS早期，外周血的單核細胞在趨化因子作用下跨內皮細胞向內皮下遷移并分化成巨噬細胞[3]，細胞內脂質代謝異常可促使其表型發生改變，進一步引發炎癥反應，并逐步轉化為泡沫細胞[4-5]。巨噬細胞表型轉化在AS的發生發展過程中發揮了重要作用[6]，其可通過血管內微環境改變轉化成不同的表型，主要分為經典激活的M1型和非經典激活的M2型。M1型巨噬細胞具有促炎、促氧化應激作用，而M2型巨噬細胞能發揮抗炎和促組織修復作用[7]。丹皮酚(Paeonol)是毛茛科植物牡丹根皮和蘿藦科植物徐長卿全草的主要活性成分，具有抗炎癥反應、抗氧化應激、抗血栓形成、抗腫瘤等作用。已有研究表明丹皮酚具有減輕動脈粥樣硬化炎性損傷的作用[8-9]，但是丹皮酚對AS中巨噬細胞表型轉化這一方面的研究較少。本研究利用小鼠源Raw264.7巨噬細胞復制M1極化模型，觀察丹皮酚是否通過ERα影響巨噬細胞表型轉化。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1細胞株 小鼠巨噬細胞株Raw264.7由上海拜力生物科技有限公司提供。

1.1.2試劑 丹皮酚(北京北納創聯生物公司，150914)；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)測定試劑盒(南京聯科生物公司，ARB13412)、白介素10(IL-10)測定試劑盒(南京聯科生物公司，ARB12344)、白介素1β(IL-1β)測定試劑盒(南京聯科生物公司，ARB132112)、丙二醛(MDA)測定試劑盒(南京建成生物公司，20151210)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)測定試劑盒(南京建成生物公司，ARB12843)；Arg-1抗體(北京博奧森公司，bs-23837R)；CD163抗體(北京博奧森公司，bsm-54015R)、iNOS抗體(北京博奧森公司，bs-2072R)；CD86抗體(北京博奧森公司，bs-2072R)；β-actin抗體(Bioword公司，bs-10966R)；二抗(Proteintech公司，10285-1-AP)；β-雌二醇(Sigma公司，E2758)、ERα選擇性阻斷劑MPP(Sigma公司，WAY-200070)、ERβ選擇性阻斷劑PHTPP(Sigma公司，SML1355)。

1.2 方法

1.2.1巨噬細胞培養和經典活化模型的建立 將巨噬細胞培養于含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養液中，放置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，每2～3 d換液1次。根據文獻選用100 μg·L-1LPS和20 μg·L-1IFN-γ聯用刺激巨噬細胞，復制M1極化模型[10-11]。

1.2.2活化巨噬細胞實驗分組 細胞貼壁生長于含10%胎牛血清的DMEM培養液中，取對數生長期細胞用于實驗。將細胞分為6組：對照組(control)加入DMSO(0.02%,W/V)；模型組(model)加入100 μg·L-1LPS和20 μg·L-1IFN-γ；其余4組藥物干預組分別在模型組的基礎上加入100 nmol·L-1雌激素(E2)、30 μmol·L-1丹皮酚(Paeonol)[12]、30 μmol·L-1丹皮酚+50 μmol·L-1PHTPP[13]、30 μmol·L-1丹皮酚+50 μmol·L-1MPP[13]。細胞加入相應濃度的藥物后，放置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h，每組實驗重復3次。

1.2.3ELISA法檢測巨噬細胞上清液中細胞因子的含量 選取第3～5代對數生長期的巨噬細胞，調整細胞密度為1×108·L-1，以每孔2 mL接種入6孔板中培養，細胞同期化后分組處理，分組與藥物干預方法同“1.2.2”，作用24 h后終止。收集培養上清液，3 000 r·min-1離心15 min，小心吸去上清液，按照試劑盒說明書ELISA法測定上清液中IL-10、TNF-α、IL-1β、SOD與MDA的含量。

1.2.4Western blot檢測蛋白表達 細胞分組和藥物干預同“1.2.2”。作用24 h后，提取細胞總蛋白并進行電泳，將蛋白轉移至PVDF膜上，置于含脫脂奶粉的封閉液室溫封閉2 h。TBST洗膜，加入一抗，4 ℃過夜，TBST洗膜后加入二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜，用顯影液進行顯色反應。以β-actin為內參，實驗均重復3次。

1.2.5shRNA干擾巨噬細胞ERα的表達 將轉染Control shRNA和ERα shRNA的細胞各分為3組，分別為：對照組加入DMSO(0.02%,W/V)、模型組加入100 μg·L-1LPS和20 μg·L-1IFN-γ、丹皮酚組在預先進行極化造模(同模型組)的細胞上加入30 μmol·L-1丹皮酚。再另設一組非轉染的空白組，于37 ℃、5%CO2培養箱中培養24 h后檢測巨噬細胞活化相關指標，以及提取蛋白進行Western blot實驗。

2 結果

2.1 丹皮酚對巨噬細胞經典活化相關細胞因子表達的影響實驗結果顯示，當巨噬細胞受到100 μg·L-1LPS及20 μg·L-1INF-γ作用后，與對照組相比抗炎細胞因子IL-10含量和SOD含量明顯降低，促炎細胞因子TNF-α和IL-1β含量增加以及MDA的含量明顯升高。在細胞造模基礎上給予E2和丹皮酚后，與模型組相比，IL-10和SOD含量明顯升高，且TNF-α、IL-1β及MDA含量明顯降低。與此同時，丹皮酚+MPP組與模型組相比所有細胞因子均無差異，而丹皮酚+PHTPP組與模型組相比所有細胞因子表達依然有差異，說明丹皮酚對巨噬細胞因子的效應可能被ERα選擇性阻斷劑MPP阻斷，但ERβ選擇性阻斷劑PHTPP對丹皮酚的效應影響不明顯(Fig 1)。以上結果提示，當巨噬細胞受到LPS和IFN-γ刺激后，巨噬細胞分泌促炎因子增多并加劇氧化應激過程中的活性氧等物質的產生，丹皮酚對其抑制作用與ERα有關。

2.2 丹皮酚對巨噬細胞表型轉化相關蛋白表達的影響實驗結果顯示，當巨噬細胞受到LPS及INF-γ作用后，巨噬細胞M1表型標志物iNOS、CD86的表達升高，M2表型標志物Arg-1、CD163的表達降低，與空白對照組比較差異均具有顯著性。給予E2和丹皮酚后，iNOS、CD86的表達降低，Arg-1、CD163的表達升高，與模型組比較差異均具有顯著性。同樣，丹皮酚+MPP組與模型組相比對目的蛋白的影響無差異，而丹皮酚+PHTPP組與模型組相比目的蛋白的表達存在差異，說明丹皮酚對巨噬細胞表型轉換相關蛋白的影響可能被ERα選擇性阻斷劑MPP阻斷，但ERβ選擇性阻斷劑PHTPP對丹皮酚的效應影響不明顯(Fig 2)。以上結果提示，LPS和IFN-γ可誘導巨噬細胞表型向M1型轉化，丹皮酚能夠促進巨噬細胞表型從M1型向M2型的轉化，此過程與ERα相關。

2.3 ERα對丹皮酚抗巨噬細胞經典活化相關細胞因子表達的影響利用慢病毒干擾ERα的表達，進一步驗證ERα在丹皮酚對巨噬細胞經典活化中的作用。實驗結果顯示，空載慢病毒control shRNA不影響丹皮酚對IL-10、TNF-α和IL-1β的作用。而使用慢病毒干擾ERα后，丹皮酚對巨噬細胞經LPS+INF-γ誘導極化模型的干預作用消失，表現為與極化模型組相比，丹皮酚對極化模型下的IL-10、SOD、TNF-α、IL-1β和MDA的干預無明顯差異(Fig 3)。上述結果表明，丹皮酚對M1型巨噬細胞活化的抑制作用主要是通過ERα來調控的。

2.4 ERα對丹皮酚抗巨噬細胞表型轉化相關蛋白表達的影響首先驗證空載慢病毒對丹皮酚的作用沒有影響，然后在此基礎上使用慢病毒干擾ERα觀察丹皮酚對巨噬細胞表型轉化相關蛋白的調控作用是否發生改變。實驗結果顯示，空載慢病毒control shRNA不影響丹皮酚對巨噬細胞表型轉化蛋白表達的調控，具體表現為在control shRNA組中，丹皮酚可以明顯降低由LPS+INF-γ引起的iNOS、CD86高表達，同時明顯上調由LPS+INF-γ引起的Arg-1和CD163蛋白低表達。而在ERα shRNA組中，丹皮酚的這種調控作用明顯減弱，丹皮酚給藥組和模型組之間無差異(Fig 4)。以上結果提示，丹皮酚促進LPS和IFN-γ刺激的巨噬細胞從M1型向M2型轉化，且通過ERα介導。

Fig 1 Effects of paeonol on the expression of cytokines induced by LPS and IFN-γ in macrophages

Fig 2 Effects of paeonol on LPS and IFN-γ-induced expression of macrophage phenotype-related proteins in

Fig 3 Effects of paeonol on the expression of cytokines induced by LPS and IFN-γ in macrophages

A: level of IL-10; B: level of TNF-α; C: level of IL-1β; D: level of MDA; E:level of SOD. **P<0.01 vs Control; ##P<0.01 vs Control shRNA Model；△△P<0.01 vs ERα shRNA Model

Fig 4 Effects of paeonol on the expression of LPS and IFN-γ-induced macrophage phenotype-related protein expression after ERα shRNA

3 討論

AS所致多種心腦血管疾病是全球最大的公共衛生問題之一，2020年死亡人數已增加至2 500萬，占全球死亡總數的1/3，嚴重威脅人類健康。研究表明，絕經前婦女心腦血管疾病的發病率明顯低于同齡男性，而絕經后婦女心腦血管疾病發病率明顯高于育齡婦女，更年期雌激素水平降低，雌激素受體表達異常，是更年期AS發生的病理基礎[14]。AS是一種慢性炎癥性病變，巨噬細胞參與了AS病理進程的多個環節，具有維持組織內環境穩態的作用，是一種可塑性較強的多功能免疫細胞，其表型和功能隨機體組織微環境的變化而變化，繼而激活不同亞型相關聯的信號通路和轉錄因子，發揮促炎或抗炎作用。越來越多證據表明，闡明巨噬細胞表型轉化機制有助于為治療心血管慢性炎癥性疾病提供新策略。

丹皮酚在臨床上已用于防治AS，具有保護血管內皮、抑制血小板聚集、抗氧化、調血脂等作用。本實驗研究表明，LPS及IFN-γ誘導巨噬細胞發生氧化應激反應并分泌炎性因子，產生大量iNOS、TNF-α、IL-1β等，丹皮酚能抑制M1型巨噬細胞表型標志物的表達，上調M2型巨噬細胞表型標志物的表達，抑制氧化應激反應，誘導巨噬細胞從M1型向M2型轉化，此過程與ERα相關。當ERα被特異性阻斷劑或慢病毒干擾沉默后，丹皮酚的抗炎作用降低，而特異性阻斷ERβ對丹皮酚的抗炎作用沒有明顯影響。因此，丹皮酚的抗炎作用主要是通過ERα介導的。

綜上所述，丹皮酚抑制巨噬細胞經典活化發揮抗炎抗氧化應激的作用是通過ERα介導的，有助于延緩AS的發生發展。