水稻抗稻瘟病分子機制研究進展

程新杰，岳洪亮，張夢龍，施 偉，朱國永，代金英

（江蘇沿海地區農業科學研究所，江蘇 鹽城 224000）

稻瘟病被稱為水稻“癌癥”[1]，是由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）引起的真菌性病害，是最為嚴重的水稻病害之一，且稻瘟病的危害面積和危害程度較大，發病時會影響糧食產量甚至造成絕收[2]。全球每年由稻瘟病導致的經濟損失約為660億美元[3]。因發病時期和部位不同，稻瘟病被分為苗瘟、葉瘟、節瘟和穗頸瘟等，其中尤以穗頸瘟對水稻生產的危害最大[4]。根據稻瘟病的發病條件，主要有以下防治方法：掌握防治適期，噴施相應的藥劑；處理帶病稻草和種子消毒，減少菌源；稀疏播種，培育無病壯秧苗；種植不過于密集；合理施肥、灌水，適時烤田；選用抗病良種等。在稻瘟病發病時，化學防治是最為快速有效的方法，但該方法對于環境危害巨大，不符合當今生態農業的發展目標。

目前在水稻新品種審定中，稻瘟病抗性是不可或缺的評定標準。由于稻瘟病的生理小種具有高度變異的潛力，其新基因型的產生不可避免地降低對水稻中抗性基因的敏感度[5]，同時，稻瘟病菌會產生抗藥性，進而使得化學農藥的防治效果不斷降低，這也是優良抗性品種在種植3～5年后抗性會逐漸喪失的原因[6]。因此，目前防治稻瘟病最安全有效且對環境友好的措施是挖掘新的抗稻瘟病基因，用來選育新的抗稻瘟病品種[7]。基于水稻稻瘟病的研究現狀與成果，本文主要總結了近年來水稻稻瘟病抗病機制的研究進展，對該領域的研究熱點和難點進行討論，并對未來的防控方向提供一定的思路，為今后的抗病育種工作提供一定的理論基礎。

1 水稻稻瘟病菌的侵染與防御機制

1.1 水稻稻瘟病菌侵染機制

隨著科技的進步，科研人員對稻瘟病菌侵染過程的了解更為深入，侵染路徑也已被解析[8]。稻瘟病菌是半活體的營養型真菌，其侵染過程有2個階段：在侵染水稻的初期處于活體營養階段，在這一時期主要是抑制寄主的免疫反應，進而定植在寄主細胞內；接著進入死體營養階段，在這一時期會導致寄主細胞壞死。

1.2 水稻稻瘟病防御機制

在協同進化過程中，水稻也同樣進化出復雜的防衛機制來應對稻瘟病菌的侵染，其主要有2層先天免疫系統，分別是病原菌相關模式分子誘發的免疫機制（PAMP-triggered immunity，PTI）與病原菌效應分子誘發的免疫機制（effector-triggered immunity，ETI）[9]。這2種免疫系統均能夠誘導水稻產生稻瘟病抗病性，且這一免疫過程又被細分為3個步驟：首先是信號感知，病原菌中的PAMPs（pathogenassociated molecular patterns）或效應分子被各種受體識別；第2階段是通過G蛋白、Ca2+流等將信號傳遞并放大之后，能夠進一步激活絲裂原活化蛋白激酶和NADPH（還原性輔酶Ⅱ）氧化酶，進而釋放活性氧；第3階段是誘導防衛基因表達，并且積累抗病原物的次級代謝產物，使得細胞壁加厚，最終導致侵入位點的細胞程序性死亡等[10-12]。

1.2.1 稻瘟病PTI天然免疫系統。PTI天然免疫系統又被稱為基礎抗性[13]，稻瘟病菌分泌的PAMPs主要是被水稻細胞表面的模式識別受體（patternrecognition receptors，PRRs）識別。目前在擬南芥中，對于PTI防御機制已經有了較為系統的研究。近年來研究人員對于水稻PTI機制的研究也取得了極大的突破。如flg22與flg22的受體OsFLS2，包括其介導的內部信號通路等方面的研究均有所突破。flg22是一種細菌鞭毛蛋白，它的蛋白終端是由22個氨基酸組成的保守多肽，這一肽段具有很強的抗菌性，是鞭毛蛋白誘導植物產生抗性的重要結構[14]。flg22與其受體OsFLS2結合之后，能夠有效地激活抗病結構，這不僅提高了水稻的抗病性，同樣也能夠從根本上減少水稻稻瘟病的發生[15]。

1.2.2 稻瘟病ETI天然免疫系統。這一系統被分為2個部分，一部分是稻瘟病抗性基因的有效克隆，另一部分是抗性基因R與無毒蛋白Avr作為介質的ETI激活機制。將已克隆的抗性基因與無毒基因組合在一起后，能夠不斷調整ETI防御機制[16]，不僅能夠使得水稻稻瘟病防御機制更好地發生，還能有效減少病蟲害的發生，提高稻米產量。闡述稻瘟病抗性基因與其對應的無毒基因間的互作關系，是解析稻瘟病ETI防御機制的關鍵。

2 水稻稻瘟病抗性基因

近年來，國內外研究人員通過對水稻稻瘟病抗性基因進行大量系統化的研究，使用分子標記等方法定位了100余個稻瘟病主效抗性基因，目前已經被克隆的基因有36個，如表1所示。其中已克隆的稻瘟病抗性基因大部分位于第6和第11號染色體上，少量位于第1、第9、第12染色體上，同時第2、第4、第8號染色體上還各有1個抗性基因。第6號染色體上的抗性基因主要有Piz、Pi2、Pi9、Pizt、Pid2、Pid3、pigm、Pi5、Pi26等[17]，第11號染色體上的抗性基因主要有Pia、Pik、Pi1、Pikm、Pikp、Pb1等。

表1 已克隆的抗稻瘟病基因信息

這些抗性基因不僅表型特征不同，其來源與抗病地區也不同，不同的抗性基因抗性譜也不同。而稻瘟病菌的高度多樣性和變異性等特點，也是抗性基因多樣性的原因。Pigm是一個位于第6號染色體的廣譜性稻瘟病抗性基因，供體親本為谷梅4號，其與Pi2、Pi9、Piz-t、Pi26等基因同屬于一個基因家族或是互為復等位基因，但彼此之間的抗譜具有明顯差異。Pigm基因在粳稻中基本不存在，但對江蘇、安徽、湖北、廣東等地區的代表性稻瘟病菌種均有較好的抗性，統計表明，其對于來自世界各地的50余種菌株均表現出抗性[18]。Pi2抗菌譜也相當廣，對來自我國13個地區的790余種菌株均表現出抗性[19]。Pi9同樣也是一個稻瘟病廣譜抗性基因，對21個稻瘟病小種具有抗性[20]。

穗頸瘟對于水稻危害最為嚴重，而Pb1所介導的抗性是持久性的，并且是成株期抗性和穗頸瘟抗性[21]，這種抗性已被用于許多優良品種中[22]。研究表明，在育種工作當中，可通過選擇合適的基因組合來更好地達到對稻瘟病的抗性作用，如Pita+Pia或Pita+Pi3/5/i雙基因聚合的水稻品種均有高抗病的特性[4]。

目前已克隆的36個稻瘟病抗性基因對于稻瘟病產生抗性的生物學過程各有不同，根據蛋白結構的不同被細分為4類：一是NBS-LRR（nucleotidebinding site and leucin-rich repeat）類蛋白，如Pi1、Pib、Pi9等29個抗性基因；二是RLK（receptor like kinases）類蛋白，如Pid2，主要通過單個氨基酸差異來區別抗感病基因；三是富含脯氨酸結構域蛋白，如Pi21，主要通過蛋白功能的失活來產生抗性；四是富含ARM重復序列蛋白，如Ptr，其抗性與Pita相關，且是單子葉植物所特有的基因[23]。

3 水稻抗性蛋白與稻瘟病菌無毒蛋白間的互作機制

無毒基因作為一類能夠誘導植物產生抗病性的病原物遺傳因子，在稻瘟病菌與水稻植株產生相互作用的過程中，能夠轉錄翻譯成無毒蛋白，接著水稻中的R基因能夠識別相對應的無毒蛋白，進而產生抗性[45]。目前從稻瘟病菌中鑒定并克隆的無毒基因有12個，分別是AvrPita、PWL1、PWL2、ACE1、AvrPiz-t、Avr-Pik/km/kp、Avrpi9、Avr-Pii、Avr-Pia、Avr-Pib、AvrPi54、AvrPi-CO39。已被克隆的無毒基因中，除ACE1外都編碼分泌蛋白，而ACE1不分泌但編碼聚酮合成酶[46]。

目前已成對的抗性基因和無毒基因有Pi-ta/AVR-Pita[47]、Piz-t/AvrPiz-t、Pi9/Avrpi9、Pi-33/ACE1、Pia/Avr-Pia、Pib/Avr-Pib、Pii/Avr-Pii、Pik/km/kp/Avr-Pik/km/kp、Pi-CO39/AvrPi-CO39、Pi54/AvrPi54。除Pi9/Avrpi9、Pi-33/ACE1、Pib/Avr-Pib互作關系未知外，絕大部分水稻稻瘟病抗性蛋白與無毒蛋白間的互作關系已被解析，可分為直接互作與間接互作。Piz-t/AvrPiz-t、Pii/Avr-Pii屬于間接互作，Pi-ta/AVR-Pita、Pia/Avr-Pia、Pik/km/kp/Avr-Pik/km/kp、Pi-CO39/AvrPi-CO39、Pi54/AvrPi54則屬于直接互作。

抗性蛋白與無毒蛋白直接互作有3種方式：一是符合經典“基因對基因學說”的一個抗病蛋白對應一種無毒蛋白，Pi-ta與AVR-Pita[48]對應這種互作關系；二是2種抗病蛋白成對出現，且只對應一種無毒蛋白，Pik-1和Pik-2與AVR-Pik之間對應這一互作關系；三是2種抗病蛋白成對出現，與多個無毒蛋白互作，如Os11gRGA4和Os11gRGA5對Pia的抗性都是必需的[49]，但在防御反應的過程中，僅RGA5-A與AVR-Pia或AVR1-CO39互作，并起到重要作用。

4 展望

近些年來，由于分子生物學與生物信息學這2個學科的急速發展，水稻抗性基因的發掘鑒定、克隆及互作機制等方面的研究得到巨大進步。通過分子標記育種技術育成的抗病品種已經成功應用于農業生產當中。但是，隨著病原菌生理小種的不斷變異和種植環境的變化，單一稻瘟病抗性品種不足以應對這些問題，因此需要不斷培育新的水稻稻瘟病抗性品種。基于以上問題，稻瘟病新基因的挖掘仍是水稻稻瘟病抗性分子研究的重要基礎。基于目前的研究和育種現狀，筆者認為還存在5個方面需要更深入的研究。1）分子育種缺乏廣泛的有效抵抗多種稻瘟病菌的抗性基因。雖然近年來分子育種發展迅速，已經發現并克隆了大量的抗性基因，但這些基因在田間的抗性作用難以預測，導致在育種過程中，難以將這些抗性基因運用到相對應的致病菌株上。2）還需要開發創制更高效、且能夠與抗性基因緊密連鎖的分子標記，這對于育種工作中進行抗性基因的應用具有極大的幫助，能夠將分子育種真正運用到實際育種工作當中。3）進一步開展抗性基因與無毒基因互作的分子機理研究，挖掘新的抗稻瘟病基因，并通過轉基因技術、基因編輯技術、單倍體技術等作物育種技術，培育具有廣譜抗性的水稻新品種。4）對調控水稻稻瘟病抗性的不同路徑進行深入研究，尋找更多安全有效的防治方法。5）在育種工作當中，可嘗試選擇合適的基因組合進行應用，以達到事半功倍的效果，但對其抗病的廣譜性與持久性仍需要進一步研究。