花花柴抗逆相關(guān)基因KcCIPK9的克隆及原核表達(dá)

陸忻子墨，黃海濤，孔繁雨，李小龍，張曉楠，吳瑩瑩，楊靜，王彥芹

（塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/塔里木盆地生物資源保護(hù)利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗室，新疆 阿拉爾 843300）

植物在生長過程中往往受到多種非生物脅迫因素的影響，其中溫度脅迫與干旱脅迫是影響植物生長發(fā)育的兩類主要非生物脅迫因素。據(jù)2018年IPCC相關(guān)報告顯示，自從工業(yè)革命以來人類活動導(dǎo)致全球地表溫度較工業(yè)化前升高1℃，預(yù)計2052年此數(shù)據(jù)將提高至1.5℃［1］，全球氣候變暖導(dǎo)致的降水量重新分配，干旱災(zāi)害頻發(fā)，不僅危害自然生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定，還嚴(yán)重威脅人類的生存。然而生長于高溫干旱地區(qū)的植物在長期的進(jìn)化和適應(yīng)過程中能夠生存得益于其對脅迫的快速應(yīng)答和體內(nèi)復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制。

鈣調(diào)磷酸酶B類蛋白互作激酶(CBL-interacting protein kinase，CIPK)家族是一種參與鈣信號傳導(dǎo)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其具有一個ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性結(jié)構(gòu)域和一個能與蛋白磷酸酶（PPI）相互作用并帶有NAF/FISL序列的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域。其中激活環(huán)保守殘基的磷酸化可能對調(diào)節(jié)的酶活性至關(guān)重要［2］。Ca2+在參與誘導(dǎo)調(diào)控反應(yīng)時，細(xì)胞主要通過鈣受體蛋白的EF-hand結(jié)構(gòu)域結(jié)合Ca2+的方式來識別并傳遞Ca2+信號［3］。在植物中發(fā)現(xiàn)典型的鈣受體蛋白有鈣調(diào)蛋白(CaM)、類鈣調(diào)蛋白(CML)家族、鈣依賴蛋白激酶（CDPK）家族及鈣調(diào)磷酸酶B類蛋白（CBL）家族［4］。這類鈣受體蛋白作為信號傳導(dǎo)路徑的組成部分，在功能上被分為“信號繼電器”與“信號響應(yīng)器”［5］。同時擁有感應(yīng)元件并響應(yīng)信號產(chǎn)生功能的CDPK被歸為信號響應(yīng)器，而沒有產(chǎn)生功能卻能傳遞信號給下游的CaM與CML蛋白為信號繼電器，CBLs由于擁有一個直接與之互作的下游蛋白CIPK，其中CBLs負(fù)責(zé)信號接收和傳遞，CIPK負(fù)責(zé)產(chǎn)生環(huán)境適應(yīng)相關(guān)功能，所以CBL-CIPK可以作為雙分子響應(yīng)器［6］，并在植物響應(yīng)逆境脅迫的信號傳導(dǎo)過程中產(chǎn)生諸如抗非生物和生物逆境等重要作用。

花花柴（Karelinia caspica）是菊科花花柴屬的多年生草本植物，主要分布在我國西北干旱地區(qū)，具有優(yōu)良的耐高溫、耐旱、耐鹽堿等抗逆境脅迫的能力，是一種用于鹽堿地改良、荒漠區(qū)生態(tài)恢復(fù)的優(yōu)良植物［7］。花花柴根系發(fā)達(dá)，能吸收大量地下水分［8］，同時葉器官肉質(zhì)化，保水能力強(qiáng)［9］，葉片能合成大量蠟質(zhì)以提高其對紫外輻射和極端溫度的耐受能力［10］。正因為花花柴對極端環(huán)境的適應(yīng)，進(jìn)化形成了極強(qiáng)的耐高溫、耐旱、耐鹽堿等廣譜抗逆性，是研究植物抗逆性和挖掘抗逆基因的寶貴資源。

本試驗通過克隆荒漠植物花花柴的KcCIPK9基因，并在E.coli中分析其抗逆性功能，為KcCIPK9基因在植物中的功能驗證及經(jīng)濟(jì)作物抗逆性分子育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗所用花花柴種子采自塔里木盆地沙漠公路附近（40°36′N，80°57′E），當(dāng)?shù)睾０胃叨葹?82 m，采樣時間為2020年10月5日北京時間14時，當(dāng)?shù)貧鉁貫?1℃。所采集的花花柴種子在室內(nèi)發(fā)芽，待花花柴幼苗培養(yǎng)至6～8片真葉時備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設(shè)計

提取花花柴總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果設(shè)計KcCIPK9特異性引物，以花花柴cDNA為模板克隆KcCIPK9基因，將KcCIPK9基因構(gòu)建至E.coli表達(dá)載體pET28a中，將重組質(zhì)粒pET28a-KcCIPK9轉(zhuǎn)至E.coliBL21中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，利用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析KcCIPK9基因的原核表達(dá)情況。最后分別在高溫和干旱處理下分析E.coliBL21的繁殖速率，由此分析KcCIPK9的抗逆功能。

1.2.2 總RNA的提取與cDNA的反轉(zhuǎn)錄

1）將處理好的花花柴樣品，使用RNA提取試劑盒（RNAprep Pure天根生化科技）提取花花柴幼嫩葉片總RNA。

2）用反 轉(zhuǎn) 錄 試 劑盒（EasyScript? All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR北京全式金生物科技）將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并將所獲得cDNA于-20℃冷凍保存。

1.2.3KcCIPK9基因的克隆

1）引物設(shè)計。根據(jù)試驗室前期結(jié)果對花花柴轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序，分析所測得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)利用primer 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計，引物序列如表1所示。

表1 引物序列

2）PCR反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)使用艾本德Mastercycler?nexus PCR儀器進(jìn)行，PCR反應(yīng)體系如表2所示。

表2 PCR反應(yīng)體系

3）PCR反應(yīng)程序。預(yù)變性94℃3 min；94℃解鏈30 s；55℃退火30 s；72℃延伸90 s；30個循環(huán)，72℃延伸5 min。

4）PCR產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳，并用天根瓊脂糖回收試劑盒膠回收目的DNA片段，將目的片段連接到pMD-18T克隆載體上，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，將鑒定的陽性克隆送至北京睿博興科生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.4 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

用限制性內(nèi)切酶XbaI與HindIII分別酶切T載體和原核表達(dá)載體pET28a，分別回收目的基因和pET28a的大片段，在T4 DNA ligase的作用下連接pET28a與KcCIPK9，將連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布到含有25 μg/mL卡那霉素抗生素的LB固體培養(yǎng)基上，過夜培養(yǎng)后挑取單菌落，利用菌落PCR與質(zhì)粒酶切驗證鑒定；將鑒定的陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coliBL21，同樣利用菌落PCR鑒定陽性轉(zhuǎn)化子。

1.2.5 原核表達(dá)蛋白的提取及SDS-PAGE檢測

將上述轉(zhuǎn)化的E.coliBL21陽性菌株在含有卡那霉素抗生素的液體LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)12 h，至OD600為0.6～0.8時，加入0.5 mmol/L異丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropy-8-d-thiogalactoside，IPTG)，分別取誘導(dǎo) 2 h、4 h、6 h的菌液，于 12000 r/min離心2 min，去上清，于沉淀中加入pH 8.0、10 mmol/L磷酸緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）1 mL，重懸后于12000 r/min離心2 min，去上清，于沉淀中加入1×上樣緩沖液200 μL，煮沸10～15 min，對上清和沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE檢測。

1.2.6 重組菌非生物脅迫耐受性檢測

高溫處理：以37℃、42℃、47℃、50℃為溫度梯度，將實(shí)驗樣品分別在培養(yǎng)4 h、6 h、8 h、10 h、12 h時取樣，測定菌液在OD600處的吸光值。

模擬干旱處理：配置含3%、6%、9%及15%的聚乙二醇-4000（Polyethylene glycol-4000，PEG-4000）的液體LB培養(yǎng)基，分別在實(shí)驗樣品培養(yǎng)4 h、6 h、8 h、10 h、12 h時取樣，測定菌液在OD600處的吸光值。

2 結(jié)果分析

2.1 KcCIPK9基因的克隆與原核表達(dá)

2.1.1KcCIPK9的序列分析

通過對花花柴KcCIPK9基因PCR結(jié)果的電泳檢測，發(fā)現(xiàn)在1000～1500 bp處有一條亮帶（如圖1a）；并對構(gòu)建到pMD-18T載體后轉(zhuǎn)化的E.coli進(jìn)行菌落PCR鑒定（如圖1b）,結(jié)果表明載體構(gòu)建成功。

將構(gòu)建的原核表達(dá)載體pET28a-KcCIPK9通過雙酶切驗證，在瓊脂糖凝膠電泳中出現(xiàn)兩條帶，其中一條約5000 bp的條帶為pET28a的載體，另一條1000～1500 bp之間的條帶為KcCIPK9基因（見圖1c），表明原核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖1 KcCIPK9的克隆及原核表達(dá)載體連接鑒定

通過測序分析（如圖2），發(fā)現(xiàn)以上所克隆基因的ORF全長為1395 bp，編碼464個氨基酸，通過在NCBI上比對發(fā)現(xiàn)，其與擬南芥AtCIPK9的同源性高達(dá)95%，本試驗中命名為KcCIPK9。

圖2 KcCIPK9測序結(jié)果

2.1.2KcCIPK9基因的原核表達(dá)

通過對KcCIPK9基因原核表達(dá)蛋白的SDS-PAGE檢測，結(jié)果表明分別在誘導(dǎo)4 h和6 h條件下有較明顯的蛋白條帶（如圖3），該條帶約為50 kDa，與KcCIPK9基因的編碼蛋白條帶大小相符，表明KcCIPK9基因可以在E.coli中表達(dá)。而空載體，誘導(dǎo)時間較短的處理中未見KcCIPK9蛋白條帶。

2.1.3 重組菌非生物脅迫耐受性結(jié)果分析

高溫脅迫組試驗結(jié)果表明，在37℃條件下，重組載體轉(zhuǎn)化菌的生長速率相比空載體轉(zhuǎn)化菌的生長速度較慢（如圖4a），在42℃條件時兩種細(xì)菌的繁殖速率差別不明顯（如圖4b），但在47℃、50℃條件下，重組載體轉(zhuǎn)化菌的生長速率明顯高于空載體轉(zhuǎn)化菌的生長速率（如圖4c和圖4d），兩種細(xì)菌的繁殖速率隨著溫度的升高在顯著降低，但含有KcCIPK9的菌株在高溫條件下的繁殖速率高于不含該基因的菌株。

此外PEG滲透脅迫實(shí)驗組的結(jié)果表明，當(dāng)PEG-4000的濃度在6%以下時（見圖5a和圖5b），兩種轉(zhuǎn)化菌的繁殖速率幾乎無差別；當(dāng)PEG-4000的濃度為9%和15%時（見圖5c和圖5d），重組載體轉(zhuǎn)化菌的繁殖速率明顯高于空載體轉(zhuǎn)化菌，總體上，隨著PEG-4000濃度的升高，兩種轉(zhuǎn)化菌的增長速率都在降低。該結(jié)果顯示KcCIPK9基因在一定程度上具有增強(qiáng)E.coli在較高濃度PEG-4000條件下的繁殖速率。

圖5 液體培養(yǎng)環(huán)境中重組菌的PEG-4000滲透脅迫耐受表現(xiàn)結(jié)果

3 結(jié)論

本試驗從荒漠植物花花柴中成功克隆了KcCIPK9基因的ORF全長，測序結(jié)果表明該基因長1395 bp，編碼464個氨基酸，其與擬南芥AtCIPK9的同源性為95%；通過構(gòu)建原核表達(dá)載體并在E.coli中誘導(dǎo)表達(dá)，獲得一條約50 kDa的蛋白條帶，這與預(yù)期結(jié)果相符。對KcCIPK9基因在E.coli中的抗逆性功能分析，結(jié)果表明該基因在50℃高溫下使陽性轉(zhuǎn)化菌的繁殖速率明顯高于陰性轉(zhuǎn)化菌，同樣，該基因在15%的PEG-4000環(huán)境下使陽性轉(zhuǎn)化菌的繁殖速率明顯高于陰性轉(zhuǎn)化菌，表明KcCIPK9基因具有耐高溫和耐旱的功能。

花花柴因其所具有的抗逆性狀及保水固沙的作用在新疆沙漠植物群落中占有重要地位，朱傳應(yīng)等［11］研究表明花花柴會通過高溫對CBL-CIPK通路的誘導(dǎo)表達(dá)來提高其對高溫的耐受性。DE LA TORRE F等［12］通過沉默煙草NbCBL10與NbCIPK6發(fā)現(xiàn)CBL-CIPK信號系統(tǒng)能夠與NADPH氧化酶RBOHB互作以此調(diào)節(jié)ROS的產(chǎn)生，來達(dá)到激活煙草的局部細(xì)胞程序性死亡（PCD）病原體免疫反應(yīng)的目的［12］。在鹽脅迫方面，小麥TaCIPK14、TaCIPK29和玉米ZmCIPK21在鹽脅迫條件下會在鈉離子轉(zhuǎn)運(yùn)、ROS代謝、鉀離子平衡和ABA信號傳導(dǎo)方面起一定作用［13-15］。二穗短柄草BdCIPK31基因則通過ABA信號通路增強(qiáng)植株對干旱和鹽脅迫的抗性［16］。而油菜中多組CBL-CIPK對鹽、干旱、冷、熱、ABA、甲基紫精（MV）和低鹽脅迫可以作出反應(yīng)［17］，同時對大豆CIPK家族基因的研究表明干旱脅迫也會誘導(dǎo)CIPK家族基因的表達(dá)［18］。KcCIPK9基因在原核細(xì)胞上的優(yōu)良表現(xiàn)，使得KcCIPK9基因在真核層面上的抗逆性表現(xiàn)也具有很大的可能。試驗結(jié)果也為后續(xù)真核細(xì)胞層面及植物個體上的研究提供了試驗基礎(chǔ)及理論依據(jù)。