濕解西蘭花尾菜制備富里酸及其抗氧化活性研究

李順勤，賈永秀，賈洪玉，隋文杰*，張 民，劉 銳，吳 濤

（1.天津科技大學省部共建食品營養與安全國家重點實驗室，天津 300457；2.天津科技大學食品科學與工程學院，天津 300457；3.山東省農業科學院農業資源與環境研究所，山東濟南 250100；4.天津農學院，天津 300384）

尾菜是指蔬菜在種植、采收、運輸、銷售及生產加工環節中無法利用或被拋棄的部分[1-3]。尾菜含水率一般70%～95%，pH 6.0～9.0，可溶性固形物含量5%～19%，主要干物質包括纖維素、半纖維素、木質素、碳水化合物、蛋白質、脂質、礦物質、維生素等[4-5]。大規模無法利用的尾菜，造成嚴重的資源浪費和環境污染[6]。據國家統計局數據顯示，2019 年我國蔬菜年產量在7.9 億t 以上，尾菜量保守估計至少達2.63 億t[7]。因此，尾菜治理與資源化利用已成為亟需解決的難題。

目前，尾菜的處理方式主要有直接還田、堆肥、青貯飼料與沼氣利用等，在實際處理中受制于占地面積大、處理周期長與產品附加值低等多種因素[8-10]。濕解技術作為一種常用的生物質水熱預處理手段，已逐漸被用于食品領域[11-13]。將尾菜置于反應罐，利用飽和蒸汽加熱達到設定溫度，并維持一定時間，短時間內使尾菜組織快速升溫升壓，促進物料發生水熱降解與聚合反應，經過一系列縮合反應，從而轉化成為穩定的腐植酸類物質[14-15]。腐植酸（humic substances，HS）是一類呈棕黑色或棕褐色，酸性、無定形的有機大分子物質。依據溶解性差異，腐植酸可分為富里酸、胡敏酸和胡敏素[16]。其中，富里酸（fulvic acid，FA）具有水溶性好、分子量小、氧化還原能力較強等優點，含羧基、羥基、酚羥基等多種活性官能團，在消炎、減輕潰瘍、抗氧化等方面有顯著療效[17-19]。

基于以上尾菜產生與利用過程中存在的處理周期長、產品附加值低的問題，本研究采用濕解技術處理西蘭花廢棄根莖并從中提取純化得到富里酸，并進一步考察富里酸的總還原能力以及對ABTS+自由基、DPPH 自由基、羥基自由基（·OH）、超氧陰離子自由基（O2·-）的清除能力，為尾菜資源化利用及產品開發提供技術指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

西蘭花根莖，收集于天津科技大學泰達校區第二學生餐廳。

無水乙醇、氫氧化鈉、抗壞血酸鈉、過硫酸鉀、過氧化氫、水楊酸、磷酸二氫鈉、硫酸亞鐵、磷酸氫二鈉、鄰苯三酚、鐵氰化鉀、三氯化鐵與三氯乙酸等，均為分析純，購自國藥化學試劑有限責任公司。

三羥甲基氨基甲烷、ABTS、DPPH，生化試劑，國藥化學試劑有限責任公司。

濃鹽酸（質量分數36%～38%），天津市風船化學試劑科技有限公司。

1.2 儀器與設備

QBS-200B 試驗臺，河南鶴壁正道生物能源有限公司；CP64 電子天平（0.000 1 g），上海奧豪斯儀器有限公司；MODULYOD-203 真空冷凍干燥機，美國Thermo fisher 科技公司；DH-101 電熱恒溫鼓風干燥箱，天津中環實驗電爐公司；XMTD-204 數顯式電熱恒溫水浴鍋，天津市歐諾儀器儀表有限公司；SHZ-82A 振蕩器，常州國華電器有限公司；TU-1810 紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 富里酸制備

1.3.1 西蘭花濕解處理

將新鮮的西蘭花根莖切片，于70 ℃鼓風干燥箱中烘至相對含水率為40%。取250.0 g 原料置于反應罐內，通入飽和水蒸氣至1.1 MPa（184 ℃）、1.7 MPa（204 ℃）與2.3 MPa（220 ℃），并維持10 min，迅速打開卸料閥泄壓放料，收集濕解物料，自然風干后保存待用。

1.3.2 富里酸提取純化

將濕解物料與原料置于105 ℃鼓風干燥箱中干燥4 h，參考NY/T 1867—2010 富里酸含量測定[20]。參考IHSS推薦的方法，提取純化富里酸[21]。稱取3.0 g 濕解物料或原料，加入0.1 mol/L 氯化氫溶液100.0 mL，在室溫下振蕩提取，1 h 后放置過夜，搖勻離心，并用中速濾紙過濾，濾液即為富里酸。并采用XAD-8 型樹脂和鈉型732 陽離子交換樹脂柱進行洗脫純化，冷凍干燥后于70 ℃鼓風干燥箱內烘干，研細并稱量質量，即得純化富里酸樣品。

1.4 富里酸抗氧化性測定

1.4.1 ABTS+自由基清除率測定

參考包騏林等[22]的方法。稱取20.0 mg 富里酸，加20 mL 蒸餾水配制成1.0 mg/mL，分別稀釋為不同梯度富里酸溶液（0.001～1.0 mg/mL）。

ABTS 溶液配制方法：稱取過硫酸鉀與ABTS，配制成終濃度為7.0 mmol/L 的溶液，在黑暗室溫下反應12 h。設定波長為734 nm，采用pH 7.4 的PBS 緩沖液稀釋反應液至吸光度值A0為0.7±0.02，作為待用溶液。

吸取2.0 mL 不同濃度富里酸溶液（0.001～0.05 mg/mL），加入4.0 mL ABTS 稀釋液，緊接著渦旋30 s，于室溫下避光反應10 min。以VC 為陽性對照，在734 nm處測定吸光度值A1。通過公式（1）計算其對ABTS+自由基的清除率。

1.4.2 DPPH 自由基清除率測定

參考左玉等[18]的方法。樣品溶液配制方法如1.4.1 所述。加入2.0 mL、0.10 mmol/L DPPH 溶液，渦旋30 s，在黑暗室溫下反應30 min。設定波長為517 nm，以蒸餾水為參比，測定樣品反應液吸光度，記為A1。將2.0 mL DPPH溶液與2.0 mL 蒸餾水振蕩均勻測定吸光度A0。將2.0 mL無水乙醇與2.0 mL 樣品溶液振蕩均勻，測定吸光度A2。按照公式（2）計算其對DPPH 自由基的清除率。

1.4.3 羥基自由基（·OH）清除率測定

參考段景峰等[23]的方法。樣品溶液配制方法如1.4.1所述。取2.0 mL 6 mmol/L 過氧化氫溶液、2.0 mL 6 mmol/L FeSO4溶液與2.0 mL 樣品溶液，振蕩均勻，置于37 ℃水浴鍋中反應10 min，緊接著加入2.0 mL 6 mmol/L水楊酸溶液，置于水浴鍋中反應30 min 后取出。設定波長為510 nm，以蒸餾水為參比，測定樣品反應液的吸光度，記為A1。同理2.0 mL 過氧化氫溶液、2.0 mL FeSO4溶液、2.0 mL 蒸餾水、2.0 mL 樣品溶液振蕩均勻，測定吸光度A2。2.0 mL 過氧化氫溶液、2.0 mL FeSO4溶液、4.0 mL蒸餾水振蕩均勻，測定吸光度A0。按照公式（3）計算其對·OH 自由基的清除率。

1.4.4 超氧陰離子自由基（O2·-）清除率測定

參考左玉等[18,23]的方法，樣品溶液配制方法如1.4.1所述。預先設定水浴鍋溫度為25 ℃，取pH 8.2 的Tris-HCl 緩沖溶液5.0 mL 于試管中，置于水浴鍋20 min。將0.5 mL 鄰苯三酚溶液（濃度5.0×10-3mol/L）與2.0 mL 樣品溶液依次加入，渦旋30 s，進行水浴反應4 min。設定波長為320 nm，以1.0×10-2mol/L HCl 溶液為參比，測定樣品反應液的吸光度A1；將上述樣品溶液替換為2.0 mL 蒸餾水，測定吸光度A0；將鄰苯三酚溶液替換為0.5 mL HCl 溶液，測定吸光度A2。按照公式（4）計算其對O2·-自由基的清除率。

1.4.5 總還原力測定

參考左玉等[18]報道的方法，樣品溶液配制方法如1.4.1所述。取1.0 mL 樣品于試管中，依次加入磷酸鹽緩沖液（pH 6.6、0.2 mol/L）2.0 mL 和1%鐵氰化鉀溶液2.0 mL，渦旋30 s，置于50 ℃水浴鍋中反應20 min 后，加入10%三氯乙酸溶液2.0 mL 結束反應。取上述反應液2.0 mL 于試管中，依次加入2.0 mL 蒸餾水、0.4 mL 三氯化鐵（質量分數為0.1%），在室溫下避光反應30 min。設定波長為700 nm，測定樣品反應液與平行實驗組吸光度值，取平均值。

1.5 數據處理

數據處理利用SPSS statistics 24 統計軟件，組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），檢驗水準P＜0.05，作圖采用Origin 9.0 軟件。

2 結果與分析

2.1 濕解富里酸條件優化

如圖1 所示，未純化前，原料直接提取的富里酸含量為118.1 g/kg；隨著濕解溫度的增加，富里酸含量呈逐漸增加的趨勢，當條件為220 ℃、10 min 時，濕解后富里酸含量最高，為166.6 g/kg，較原料直接提取提高了38.0%。研究結果表明，濕解處理可以提高物料中富里酸含量。

由于提取方法為酸提，未純化的富里酸中可能含有大量的單糖、氨基酸、多肽等物質，為考察濕解處理對富里酸得率的實質影響，進一步對粗富里酸進行樹脂純化分離。如圖1 所示，原料中的富里酸純化后得率為6.1 g/kg；濕解溫度為204 ℃時，純化后富里酸得率最高，為32.9 g/kg，為原料提取的5.4 倍；隨著濕解溫度的增加，富里酸得率呈先上升后降低的趨勢，說明濕解處理可促進半纖維素中乙酰基的斷裂，顯著提高富里酸產率；但溫度過高，過于激烈的反應環境不利于半纖維素、纖維素等物質降解產物的穩定存在，促使富里酸進一步縮聚或降解為甲酸、糠醛等揮發性成分。因此，濕解富里酸的最適條件為204 ℃、10 min。

圖1 純化前后濕解富里酸的得率Fig.1 The yield of FA from treated samples before and after purification

2.2 富里酸對ABTS+自由基的清除能力

如圖2 所示，隨著濃度增加，富里酸清除ABTS+自由基的效果明顯增強。以VC 作為對照，發現富里酸具有較強的ABTS+自由基清除能力。當添加量為0.05 mg/mL時，富里酸對ABTS+自由基清除率為98.9%。富里酸中羧基和醌基等官能團形成的芳香共軛體系，同APTS+自由基結合變為ABTS，導致溶液藍綠色減弱或消失[19]。

圖2 富里酸的ABTS+自由基清除率Fig.2 APTS+radical scavenging of FA

2.3 富里酸對DPPH 自由基的清除能力

DPPH 自由基是一種穩定的含氮芳香環自由基[24]。如圖3 所示，在0.01～1.0 mg/mL 范圍內，隨著濃度的增加，富里酸清除DPPH 自由基作用明顯增強；當添加濃度為0.50 mg/mL 時，富里酸對DPPH 自由基清除率為97.4%，同富里酸濃度為1.00 mg/mL 時對DPPH 自由基的清除率相近。研究結果表明，富里酸具有較強的DPPH 自由基清除能力，可能是破壞了N-中心自由基穩定性而達到清除效果。富里酸中羧基和醌基等官能團形成的芳香共軛體系[18]，同DPPH 自由基的孤對電子配對，導致吸收度減弱或消失[19]，富里酸對DPPH 自由基清除作用與濃度呈一定線性量效關系。

圖3 富里酸的DPPH 自由基清除率Fig.3 DPPH radical scavenging capacity of FA

2.4 富里酸對羥基自由基（·OH）的清除能力

如圖4 所示，在0.2～1.5 mg/mL 范圍內，富里酸清除·OH 的能力隨濃度增加而逐漸增強。當添加濃度為1.5 mg/mL 時，富里酸對·OH 清除率為43.3%，同等濃度下VC（對照）對·OH 清除率接近100%。研究結果表明，富里酸具有一定的·OH 清除能力。·OH 是導致體內脂質過氧化反應的一種活躍的自由基[19]，富里酸中活性基團同羥基自由基結合，終止自由基介導的氧化鏈式反應，抑制脂質過氧化[19]。

圖4 富里酸的·OH 清除率Fig.4 ·OH scavenging of FA

2.5 富里酸對超氧陰離子自由基（O2·-）的清除能力

O2·-在人體中數量眾多且分布最廣。如圖5 所示，在0.05～1.0 mg/mL 范圍內，富里酸清除O2·-作用隨著濃度增加逐漸增強。當濃度達到1.0 mg/mL 時，富里酸的O2·-清除率為56.7%，同等濃度下VC（對照）的O2·-清除率為99.9%。研究結果表明，富里酸具有一定的O2·-清除作用。富里酸中羧基和醌基等官能團形成的芳香共軛體系，同O2·-結合，達到清除效果[19]，且富里酸的O2·-清除作用與濃度呈正相關。

圖5 富里酸的O2·-清除率Fig.5 O2·-scavenging of FA

2.6 富里酸總還原力

如圖6 所示，隨著濃度增加，富里酸的總還原力逐漸增大。當濃度為0.5 mg/mL 時，富里酸的總還原力吸光值為1.0；以同等濃度VC 為對照，其吸光度值為3.3。研究結果表明，富里酸總還原力為VC 的三分之一左右，具有一定的還原能力。富里酸中的部分活性基團作為電子給予體，將Fe3+還原為Fe2+，破壞自由基鏈反應的電子供體，達到清除自由基的效果[19]。

圖6 富里酸的總還原力Fig.6 Reduction capacity of FA

3 結論

研究表明，以富里酸得率為指標，得出濕解處理西蘭花根莖的最適條件為204 ℃、10 min，富里酸得率為162.96 g/kg，相比原料提高38.0%。進一步采用酸提、XAD-8 型樹脂和鈉型732 陽離子交換樹脂制備富里酸，經純化后富里酸得率為32.9 g/kg。在0.5 mg/mL 添加濃度下，濕解富里酸對ABTS+自由基和DPPH 自由基的清除率超過90%，對羥基自由基和超氧陰離子自由基的清除率分別為14.1%與32.3%。可見，富里酸具有較強的ABTS+自由基、DPPH 自由基清除能力，以及一定的羥基自由基、超氧陰離子自由基清除能力，且隨著濕解富里酸濃度的增加，其抗氧化作用增強。