芹菜素經(jīng)上調(diào)miR148a-3p 表達(dá)抑制MHCC97H 細(xì)胞遷移和侵襲

劉麗華，孫 菲，周志凌，張堅(jiān)松

（1. 珠海市人民醫(yī)院/暨南大學(xué)附屬珠海醫(yī)院，珠海 519000；2. 湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410013）

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的高侵襲轉(zhuǎn)移是亟待解決的臨床治療難題［1］。新近的研究顯示非編碼調(diào)控性微小RNAs（microRNAs）能有效地抑制HCC 細(xì)胞遷移和侵襲［2，3］。我們先前的研究證明芹菜素（apigenin，API）類(lèi)似物異牡荊素抑制HCC 腫瘤干細(xì)胞特性和侵襲能力［4］，然而，其作用機(jī)制尚未完全闡明。本文旨在研究API 是否通過(guò)上調(diào)miR-148a-3p 表達(dá)抑制體外HCC 細(xì)胞遷移和侵襲能力。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)與處理 高侵襲性人肝細(xì)胞癌MHCC97H 細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)（中國(guó)上海市）。按照先前文獻(xiàn)的描述［4］，細(xì)胞放置在37°C、飽和濕度的5% CO2 培養(yǎng)箱中單層貼壁生長(zhǎng)；然后，通過(guò)陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染miR-148a-3p 模擬物或不同濃度的API（apigenin，API：5、10 和20μM）或API（20μM）聯(lián)合miR-148a-3p 抑制物轉(zhuǎn)染MHCC97H 細(xì)胞處理24 小時(shí)。

1.2 miRNA 轉(zhuǎn)染 如先前文獻(xiàn)［5］的闡釋的方法，按照制造商的說(shuō)明（RiboBio，中國(guó)廣州市），用iboFECT?CP 試劑將micrON?miR-148a 模擬物（50 nM）或抑制物（100 nM）轉(zhuǎn)染入MHCC97H 細(xì)胞。同時(shí)，按照相同的方法和步驟轉(zhuǎn)染miR-148a-3p 模擬物的陰性對(duì)照（miRCtrl）或miR-148a-3p 抑制物的陰性對(duì)照（Anti-Ctrl）。

1.3 實(shí)時(shí)定量PCR 參考文獻(xiàn)［5］的實(shí)驗(yàn)方法，用miRcute miRNA 分離試劑盒（cat. DP501，Tiangen Biotech，中國(guó)）制備總microRNA。基于TaqMan MicroRNA 分析（Applied Biosystems）的All-in-One?miRNA qRT-PCR 檢測(cè)試劑盒轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增總miRNA（2μg），以測(cè)定microRNA 的量。用2-ΔΔCt方法分析結(jié)果。研究使用的引物是：成熟miRNA-148a-3p（F：TGCGGTCAGTGCACTACAGAAC；R：CCAGTGCAGGGTVVGAGGT）和內(nèi)參U6（F：5'-CGC TTC GGC AGC ACA TAT ACT A-3'；R：5'-CGC TTC ACG AAT TTG CGT GTC A-3'。

1.4 劃痕法 參照文獻(xiàn)［4］的描述，轉(zhuǎn)染的MHCC97H細(xì)胞或不同濃度的API（apigenin，API：5、10 和20μM）或API（20μM）聯(lián)合miR-148a-3p 抑制物處理細(xì)胞接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，生長(zhǎng)至90%匯合度。然后，用無(wú)菌的100μL 微量移液器的吸頭垂直劃過(guò)形成傷口。接下來(lái)，洗滌細(xì)胞并分別于0 和24h 時(shí)在放大倍數(shù)為100 的視野中拍照分析。……