miR-34a-5p 下調Notch1 表達增強三陰性乳腺癌MDAMB-231 細胞對紫杉醇的敏感性

蔡 霈，樂伊婕，邱葉貝，鄭 藝，李 慧，曹建國，李 程，佘志華

（1.湖南省婦幼保健院，長沙 410008；2. 湖南師范大學醫學院，長沙 410006）

MicroRNA-34a（miR-34a）是一種內源性小非編碼單鏈RNA，亦是一種重要的腫瘤抑制性miRNA［1］。miR-34a 在正常組織中高表達；而在各種類型腫瘤，如肝細胞癌和胰腺癌中通常表觀遺傳沉默［2，3］。miR-34a能直接靶向抑制多種在惡性腫瘤發生和發展中起重要作用的致癌性轉錄因子、信號分子和CSC 標志物，包括CD44 和Notch-1 等［4，5］。本文旨在探討miR-34a-5p 對三陰性乳腺癌MDA-MB-231 細胞Notch1 表達和紫杉醇敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞培養 人乳腺上皮細胞MCF-10A、人乳腺癌MDA-MB-231 細胞系購自中國科學院細胞庫（中國上海）；用含10%胎牛血清（FBS）、100 IU/mL 青霉素和 100μg/mL 鏈霉素的DMEM 培養基培養。置于含5%CO2培養箱中37℃培養。

1.2 實時熒光定量PCR 以TRIzol 試劑（美國，Life Technologies）提取MCF-10A、MDA-MB-231 細胞總RNA，按照Transcriptor First Strand cDNA Synthesis 試劑盒說明書操作將其逆轉錄合成為cDNA。以TaqMan實時熒光定量PCR（美國，Applied Biosystems）進行qRT-PCR 測定，2-△△Ct方法分析測定結果。miR-34a-5p 引物（廣州銳博生物科技公司）：F：5'-CGG TAT CAT TTG GCA GTG TCT-3'；R：5'-GTG CAG GGT CCG AGG T-3'。Notch1 引物（上海生工生物工程公司）：F：5'GGTGAGACCTGCCTGAATG'，R：5'GTTGGGGTCCTGGCATC 3'。

1.3 miR-34a mimic 瞬時轉染 miR-34a mimic（貨號：miR10004557-1-5）由廣州銳博生物科技公司提供。以Lipofectamine2000 質粒轉染系統將miR-34a mimic 轉染MDA-MB-231 細胞 24h。使用TRIzol 試劑（Invitrogen）從轉染后的MDA-MB-231 細胞中提取總RNA，以定量PCR 技術檢測miR-34a-5p 與Notch1 表達水平。

1.4 Western blot 檢驗 按前述發表文獻所述［6］，以RIPA 裂解緩沖液（Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA）于冰浴中裂解所收集的上述細胞30min，BCA 試劑盒（Pierce，Rockford，IL）測定蛋白濃度，每個樣品等量（40μg）以10% SDS-PAGE 分離后電轉至PVDF膜，5% BSA 室溫封閉1h，一抗β-actin（Santa Cruz Biotechnology，Inc，CA，USA，貨號：sc-7210）、Notch1（Cell Signaling Technology，Inc. Danvers，MA，USA，貨號：#3608）4℃孵育過夜。TBST 洗凈后以辣根過氧化酶標記山羊抗兔IgG 二抗室溫孵育1 h，ECL 試劑檢測蛋白條帶，化學發光系統（美國，Amersham Pharmacia Biotehc）拍照，以Image J 軟件計算灰度值。

1.5 CCK-8 法檢測細胞存活力 取對數生長期的MDA-MB-231 細胞（miR-34a mimic 轉染/亂序陰性對照）接種于96 孔培養板中，4000 個/每孔。……