反硝化產堿菌Alcaligenes sp.TB氧化亞氮還原酶基因的克隆表達及酶學性質研究

夏筱媛，顧思揚

(1.湖州學院 生命科學系，浙江 湖州 313000；2.湖州生態環境監測中心，浙江 湖州 313000)

隨著全球氣候的日益變暖，調控溫室氣體的排放變得十分必要而且緊迫。除了CO2和CH4以外，N2O是另一種重要的溫室氣體[1]。據報道，大氣中N2O的體積分數每增加一倍，全球地表氣溫將上升約0.4 ℃，其增溫潛能是CO2的190～270倍，CH4的4～21倍，對全球溫室效應的貢獻約占6%，預計將來可能達到10%[2-3]。同時，N2O的大量排放還會造成嚴重的臭氧層空洞致使人類患皮膚類疾病的風險驟然增高[4]。因此，消除和控制N2O成為了一項迫在眉睫的工作。

好氧反硝化菌的發現為生物脫氮技術提供了一個嶄新的思路。好氧脫氮技術具有以下優點：①硝化/反硝化反應在同一個反應器中進行可節約成本并縮短處理周期；②好氧反硝化菌更易控制；③硝化的產物可直接作為反硝化作用的底物，避免了硝酸、亞硝酸的積累對硝化反應的抑制，加速了硝化-反硝化進程[5]。

圖1 反硝化功能酶和功能基因

根據氧化還原特性和光譜學分析可將氧化亞氮還原酶分為purple型和pink型[7-8]。氧化亞氮還原酶的每個亞基都包含6個Cu原子，它們排列成2個不同類型的活性中心，一個是雙核電子傳遞位點CuA，另一個是四核催化位點CuZ[9]。氧化亞氮還原酶是一種可溶性蛋白，能在低氧或缺氧條件下表達，但易受低pH的抑制。同時，它對氧濃度也比較敏感，低DO條件下取代N2成為反硝化的終產物，但只要獲得電子，N2O還原反應就不受氧的影響[10]。有氧條件下，一些好氧反硝化菌如T.pantotropha的氧化亞氮還原酶能將NO、N2O兩種氣體同時還原，這與厭氧反硝化菌的氧化亞氮還原酶相似[11]。有學者在一株施氏假單胞菌的染色體上鑒定了6個氧化亞氮還原酶基因，分別為nosL，nosY，nosF，nosD，nosZ，nosR，分別編碼190，276，308，396，637和725個氨基酸的蛋白[12]。這些基因組成長度為7924 bp的氧化亞氮還原酶類基因簇，基因之間排列緊密。研究表明，在P.stutzeriA1501，P.aeruginosaPA01，P.fluorescens等細菌中，Nos基因簇都是由上述6個基因組成[7,9,13-15]，而且在染色體上的排列順序和轉錄方向也完全一致。在反硝化酶系中，Nor，Nir和Nos基因簇按照一定順序在染色體上相鄰排列，形成島狀區域。

關于nosZ基因的調節規律還未被詳細探究，且Nos基因的表達也被證明僅能由N2O誘發。本文以實驗室篩選得到的菌株AlcaligenesdenitrificansTB作為實驗菌種，研究氧化亞氮還原酶基因在大腸桿菌中的表達及其酶學性質。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌種與質粒

實驗室從污水處理廠活性污泥中篩選得到一株好氧反硝化菌菌株反硝化產堿菌(A.denitrificans)YS，經過紫外誘變得到一株反硝化能力更強的突變菌株TB(GenBank No.JQ044686)，保存于中國典型培養物保藏中心(CCTCC No.M2011368)。菌株TB為革蘭氏陰性菌，呈桿狀，菌落顏色為白色，菌落呈小型單個菌落，凸起，不透明，表面光滑，邊緣整齊[16]。

大腸桿菌E.coliBL21(DE3)與質粒pGEM-T和pET28b購于生工生物工程(上海)有限公司。

1.1.2培養基與貯存液

LB培養基：蛋白胨10 g·L-1，酵母抽提物5g·L-1，氯化鈉10 g·L-1，pH 7.0。

用無菌水分別配備50 mg·mL-1卡那霉素(Kan)、100 mg·mL-1氨芐青霉素(Amp)、240 mg·mL-1的誘導劑(IPTG)母液，用0.22 μmmol·L-1無菌濾膜除菌后于-20℃分管保存。

50×TAE電泳緩沖液：Tris base 60.5 g，Na2EDTA·2H2O 9.3 g，冰醋酸14.275 mL，用去離子水定容至250 mL容量瓶，經超聲清洗儀超聲全部溶解后，室溫保存備用。

1×TAE電泳緩沖液：在250 mL容量瓶中添加5 mL 50×TAE，再用超純水定容至250 mL。

0.9%瓊脂糖凝膠：1×TAE電泳緩沖液100 mL，瓊脂糖0.9 g，微波爐反復加熱至完全溶解。

1.2 方法

1.2.1構建重組工程菌E.coliBL21(DE3)-pET28b-nosZ

細菌總DNA提取按照細菌基因組DNA提取試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)使用說明進行。從NCBI獲得反硝化無色桿菌AchromobacterdenitrificansNBRC 15125 (NZ_BCTQ01000008)基因組中氧化亞氮還原酶序列，設計引物進行PCR(引物序列：GW003-NF ATGTCCGACAAGAATCCCGA;GW003-NR CTACGCGGTCTTCTTCGGGT)。構建重組質粒pET28b-nosZ，再轉入大腸桿菌感受態細胞，獲得經過鑒定含重組質粒pET28b-nosZ的重組工程菌。

圖2 重組質粒pET28b-nosZ

1.2.2重組蛋白誘導條件的優化

為了確定重組菌的最佳誘導表達溫度，將其接入10 mL含有卡那抗性的LB試管中，培養過夜，作為種子液，接種2%種子液至100 mL LB培養基中，加入100 μL卡那霉素(終濃度50 μg·mL-1)，搖床轉速150 r·min-1，37 ℃培養至OD600達到0.6～0.8(約3～4 h)，加入0.5 mmol·L-1IPTG，分別在25，28，30，33，37 ℃誘導6 h左右，在4 ℃，12 000 r·min-1離心10 min收集菌體，按比例1.0 g菌體重懸于5 mL濃度為20 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液中，超聲波進行細胞破碎(功率200 W，工作5 s，間歇10 s，破碎100次)。4 ℃，12 000 r·min-1高速離心后取上清液，通過SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳確定最佳誘導溫度。

確定最佳誘導溫度后，設置終濃度0.2，0.5，1.0，1.5，2.0，3.0 mmol·L-16種不同濃度IPTG進行優化。分別設置2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0 h 6個不同條件的誘導時間進行優化。最后，同樣考察不同初始菌體濃度(OD600=0.35～1.37)對重組大腸桿菌生長和產酶的影響。

1.2.3氧化亞氮還原酶酶學性質研究

同上述1.2.2的方法制得粗酶液。粗酶液用0.45 μm的水系過濾后，保存在充滿氦氣的西林瓶中。

酶活檢測方法由文獻改進[17-19]，具體步驟如下：吸取20 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液(pH 7.0)1.5 mL、10 mmol·L-1還原型甲基紫精溶液0.2 mL、酶液0.1 mL，再加入50 mmol·L-1的連二亞硫酸鈉溶液形成藍色中間體，此混合反應液在600 nm處的吸光值(A600)保持在1.0～1.2，注入0.1 mL的N2O飽和溶液，在氧化亞氮還原酶的催化作用下，甲基紫精與連二亞硫酸鈉的藍色中間體作為電子供體向N2O提供還原性電子，褪去藍色，混合溶液的A600值逐漸降低，A600斜率降低幅度反映了N2OR酶催化反應的速率，分光光度計記錄加入前1 min至加入后4 min這5 min內A600的變化(每隔10 s測量一次)，繪制A600值的變化曲線，并計算斜率。

前1 min內的曲線斜率在-0.02～0.01為有效數據，后4 min的斜率為這段時間的平均斜率，在數值上定義，酶活力(U)=△y/底物摩爾消光系數。N2O飽和溶液采用N2O氣體向雙蒸水中持續鼓泡0.5 h的方法獲得。甲基紫精的消光系數為11.4 mmol·L-1·cm-1。

1.2.4氧化亞氮還原酶蛋白質譜分析

分別取野生菌與重組菌菌體樣品送至北京安必奇生物公司進行蛋白混合液LC-MSMS質譜檢測分析。樣品經溶液蛋白酶解、膠內蛋白酶切后將分離的肽段進入質譜儀Thermo Scientific Q Exactive進行在線檢測，定量測定兩株菌中氧化亞氮還原酶蛋白的相對含量。

1.2.5酶的提取純化

采用His標簽可溶性蛋白純化試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)對氧化亞氮還原酶進行提取純化。

1.2.6酶催化條件優化

對本試驗所用比色皿進行密封和充He處理，向反應液加1.5 mL 20 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液、0.2 mL 10 mmol·L-1還原型甲基紫精溶液，0.1 mL氧化亞氮還原酶純酶液，50 μL 50 mmol·L-1現配連二亞硫酸鈉溶液[20]。輕微振蕩搖勻后，用微量注射器注入0.1 mL的N2O飽和溶液啟動酶催化反應，測定4 min反應前后600 nm處的吸光值。以酶活最高的作為標準(即相對酶活為100%)，對各個條件下的酶活進行比較。

分別對反應溫度(30，35，40，45和50 ℃)以及反應體系pH(5.0，6.0，7.0，8.0，9.0和10.0)對酶活的影響進行了考察，并確定最佳反應溫度和pH。

2 結果與分析

2.1 氧化亞氮還原酶基因序列分析

運用DNAMAN軟件分析核酸序列的分子量、堿基組成和堿基分布。氧化亞氮還原酶核酸序列的分析結果為：堿基組成為A 405，C 656，G 589，T 267；百分比分別為A 21.13%，C 34.22%，G 30.73%，T 13.93%。分子量為：ssDNA 588.2 kDa，dsDNA 1170.3 kDa。氨基酸個數為639。

2.2 菌落PCR檢測陽性克隆

氧化亞氮還原酶基因的PCR產物經純化后，序列經密碼子優化及合成，再連接至pGEM-T載體，然后用XbaI和XhoI雙酶切，回收1900 bp左右的DNA片段；用XbaI和XhoI對pET28b進行雙酶切，回收5600 bp的片段；將這兩種片段相連接，構建目的重組質粒pET28b-nosZ，轉化入E.coliBL21(DE3)，結果見圖3。

圖3 菌落PCR瓊脂糖凝膠電泳圖

2.3 重組蛋白誘導條件的優化

將目的基因成功插入表達載體pET28b中，通過轉化至大腸桿菌BL21(DE3)，用IPTG誘導表達，超聲破碎的上清液和沉淀用SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測其表達情況。如圖4結果顯示，在經密碼子優化之后，nosZ基因得到了高效表達，在70 kDa附近檢測到目的條帶，為可溶目的蛋白且包涵體較少。

M:蛋白Marker；1:未經IPTG誘導的裂解菌液上清；2:未經IPTG誘導的裂解菌液沉淀；3:經過IPTG誘導的裂解菌液上清；4:經過IPTG誘導的裂解菌液沉淀。圖4 重組蛋白SDS-PAGE分析

2.3.1誘導劑濃度對菌體生長和產酶的影響

發酵液中誘導劑的濃度對菌體的生長和產酶均有重要影響。IPTG與阻遏蛋白結合形成復合物，使阻遏蛋白構象發生改變，從而促進目的基因的表達。IPTG的用量不僅影響菌體的生長和蛋白的表達，還影響蛋白能否在表達中正確的折疊，減少包涵體的形成[21]。

M:蛋白Marker；1:0.2 mmol·L-1；2:0.5 mmol·L-1；3:1.0 mmol·L-1；4:1.5 mmol·L-1；5:2.0 mmol·L-1；6:3.0 mmol·L-1。圖5 誘導劑濃度對nosZ誘導表達的影響

本試驗中，設置IPTG濃度為0.2，0.5，1.0，1.5，2.0，3.0 mmol·L-1，然后測定其菌體生長和蛋白含量。從圖5中可以看出，當IPTG濃度為0.5 mmol·L-1時，目的條帶最明顯，且多為可溶蛋白。當誘導劑濃度大于5 mmol·L-1時，誘導表達量逐漸降低。在圖6中，當誘導劑濃度較低時，酶活處于較高水平，在IPTG濃度為0.5 mmol·L-1時達到最大；當IPTG濃度過高，產酶開始下降。對菌體生長而言，菌體濃度隨著IPTG濃度的上升而持續下降，這主要是因為IPTG對細胞具有毒性作用。這一現象可能是由于在IPTG濃度較低時，菌體生長量較大但IPTG誘導能力不夠，而IPTG濃度較高時又會抑制菌體的生長。

圖6 誘導劑濃度對菌體生長和產酶的影響

2.3.2誘導溫度對菌體生長和產酶的影響

誘導表達溫度過高，重組蛋白合成速率太高，可能會影響功能蛋白的正確折疊從而影響活性[22]，但培養溫度過低會抑制復制、轉錄和翻譯的水平，還會影響菌體的生長速度，導致生物量的減少，同樣不利于蛋白的表達[23]。因此要選擇合適的誘導溫度，在兩者間找到一個平衡點。

本文考察了不同誘導溫度(25，28，30，33和37 ℃)對E.coliBL21(DE3)-pET28b-nosZ的生長和產酶的影響。從圖7可以看出，重組蛋白在25～37 ℃條件下都能得到表達。對菌體生長而言，菌體的生物量隨著溫度的上升而增加，說明溫度的提高有利于菌體更好地生長。同時，誘導溫度對產酶也有顯著影響，溫度為28 ℃時，產酶量最大，但溫度過高不利于目的蛋白的表達(見圖8)。隨著溫度的升高，產酶量急劇下降，這可能是由于較高的溫度增加了熱變性的作用，在細胞內容易形成不溶性的包涵體，從而導致產酶量下降。

M:蛋白Marker；1:25 ℃；2:28 ℃；3:30 ℃；4:33 ℃；5:37 ℃。圖7 誘導溫度對nosZ誘導表達的影響

圖8 誘導溫度對菌體生長和產酶的影響

2.3.3誘導時間對菌體生長和產酶的影響

誘導劑對菌體生長有一定的阻礙作用，因此，不同的誘導時間對菌體生長和酶活力都有較大的影響。本研究選擇IPTG濃度0.5 mmol·L-1，誘導溫度為28 ℃，在誘導2，3，4，5，6，7 h后分別取樣收集菌體，考察誘導時間對菌體生長和產酶的影響。結果如圖9和圖10所示，目的蛋白的表達量起初隨著誘導時間逐漸增加，但在6 h時得到最明顯的條帶。隨著誘導時間的延長，菌體量持續增加。這是因為菌體處于生長期，培養時間越長，菌體生長量越大。產酶量隨著誘導時間的增加總體呈增長趨勢，但在6 h達到最大，誘導時間繼續延長，總酶活開始略有下降，這可能是由于過長時間的誘導導致目標蛋白形成包涵體或者目標蛋白被逐漸降解。并且，細菌生長至穩定期之后，由于培養體系營養消耗殆盡導致菌體衰老、自溶，此時進一步延長誘導時間，可能會引起重組蛋白水解、變性等問題[24]。因此，選取6 h為最佳誘導時長。

M:蛋白Marker；1:2 h；2:3 h；3:4 h；4:5 h；5:6 h；6:7 h。圖9 誘導時間對nosZ誘導表達的影響

圖10 誘導時間對菌體生長和產酶的影響

2.3.4初始菌體濃度對菌體生長和產酶的影響

誘導初始的菌體濃度是影響蛋白表達的重要參數。當誘導劑添加過早，初始菌體濃度太低，會對生長細胞造成毒性，生物量和目的蛋白產量都會降低；而當誘導劑添加太晚，菌體濃度過高會使得培養基中營養物質過度消耗，從而影響產酶速率[25]。

圖11反映不同初始菌體濃度的培養體系中，加入IPTG至終濃度為0.5 mmol·L-1，28 ℃下誘導6 h后采集樣品進行電泳分析的結果。可以看出在OD600為0.51和0.67時目的條帶最明顯，且菌體濃度過低和過高的情況下蛋白表達都較低。如圖12結果顯示，菌體濃度隨著初始濃度的增大而增大，并在OD600>1.20時趨于穩定。說明在培養基營養充足時，較高的菌體濃度利于目的蛋白的表達。另外對于產酶而言，在OD600=0.67時添加誘導劑總酶活達到最大值，OD600值繼續增加酶活顯著下降。可見初始菌體濃度過大會影響蛋白活性，誘導劑添加的時機對于外源蛋白的表達效果具有顯著影響。

M:蛋白Marker；1:0.35；2:0.51；3:0.67；4:0.88；5:1.20；6:1.37。圖11 初始菌體濃度對nosZ誘導表達的影響

圖12 初始菌體濃度對菌體生長和產酶的影響

2.4 重組菌氧化亞氮還原酶活性檢測及蛋白質譜檢測

通過以發酵后收集的靜息細胞進行酶活力檢測來確定重組菌E.coliBL21(DE3)-pET28b-nosZ所表達的目的蛋白是否具有氧化亞氮還原酶活力。如圖13及表1顯示，重組菌E.coliBL21(DE3)-pET28b-nosZ酶活力約是出發菌株Alcaligenessp.TB的2.09倍，而空白對照組大腸桿菌E.coliBL21(DE3)沒有檢測到酶活，表明重組菌E.coliBL21(DE3)-pET28b-nosZ構建成功，并且在E.coliBL21(DE3)中被高效表達。另外，重組菌和出發菌的培養液中無酶活，說明氧化亞氮還原酶是胞內表達。

●表示Alcaligenes sp.TB；■表示E.coli BL21(DE3)-pET28b-nosZ；▲表示空白對照。圖13 測定N2OR酶活時A600的變化

通過對重組菌和出發菌蛋白混合液LC-MSMS質譜檢測分析，定量測定兩株菌中氧化亞氮還原酶蛋白的相對含量。如表1的結果顯示，重組菌E.coliBL21(DE3)-pET28b-nosZ蛋白混合液中氧化亞氮還原酶蛋白相對含量是出發菌株Alcaligenessp.TB的10.58倍，說明重組菌中氧化亞氮還原酶蛋白的產酶效率較出發菌有大幅提升，利于得到更多的目的蛋白。

表1 氧化亞氮還原酶活性及蛋白含量檢測

2.5 氧化亞氮還原酶的分離純化

通過對誘導表達條件的優化，取0.5 mmol·L-1IPTG濃度，初始菌體濃度約為0.67，28 ℃和6 h作為最佳條件，將E.coliBL21(DE3)-pET28b-nosZ接種于LB培養基，發酵收集菌體。菌體破碎后通過Ni-Agarose His標簽蛋白純化試劑盒(可溶性蛋白)進行提取純化，分別取重組細胞，破碎上清液和純化的氧化亞氮還原酶進行SDS-PAGE分析，結果如圖14顯示，E.coliBL21(DE3)-pET28b-nosZ成功表達了氧化亞氮還原酶nosZ，并通過純化在第6泳道獲得了大小約為70 kDa的單一條帶，其大小與理論分子量相符，說明nosZ基因得到高效表達且純化效果良好。

M:蛋白Marker；1:未經IPTG誘導的菌體總蛋白；2:未經IPTG誘導的蛋白流穿液；3:未經IPTG誘導的蛋白洗脫液；4:經過IPTG誘導的菌體總蛋白；5:經過IPTG誘導的蛋白流穿液；6:經過IPTG誘導的蛋白洗脫液。圖14 SDS-PAGE驗證氧化亞氮還原酶蛋白

2.6 反應溫度及pH對酶活的影響

由于適宜的反應溫度對酶催化反應至關重要，本文考察了不同溫度下氧化亞氮還原酶催化反應的影響，圖15代表在30，35，40，45 和50 ℃條件下檢測氧化亞氮還原酶和底物作用情況。結果顯示，溫度較低時，酶活力隨溫度上升較快，最大酶活在40～45 ℃區間，溫度過高或者過低都會影響氧化亞氮還原酶的酶活。后續的試驗以40 ℃作為反應溫度。

圖15 反應溫度對酶活的影響

考察了不同pH對酶催化反應的影響。結果如圖16所示，在40 ℃下分別于pH為5.0，6.0，7.0，8.0，9.0和10.0條件時，檢測酶與底物作用情況。當pH為7.0時，酶的活力最大，且在偏堿性條件下活力較好。pH過高或者低于6.0都會引起酶活的明顯降低。

圖16 反應體系pH對酶活的影響

3 結論

N2O是一種重要的溫室氣體，對全球溫室效應的貢獻非常顯著。研究發現在反硝化細菌中存在氧化亞氮還原酶能將其最終還原成氮氣。因此，對于氧化亞氮還原酶基因研究意義重大。本文將AlcaligenesdenitrificansTB中的nosZ基因成功克隆到原核表達載體上并成功構建重組工程菌BL21(DE3)-pET28b-nosZ。將重組菌在IPTG誘導下表達并對誘導條件進行優化，然后對比分析重組菌與工程菌的酶活及蛋白相對含量。粗酶液經鎳親和層析純化得到純度較高的目的蛋白，并對該蛋白酶學性質進行了研究。主要結論有：用XbaI和XhoI雙酶切將目的片段連接到表達載體pET28b上，再轉化至大腸桿菌E.coliBL21(DE3)中成功構建重組質粒pET28b-nosZ；利用IPTG成功誘導得到目的蛋白，得到最佳誘導條件為：誘導劑IPTG終濃度為0.5 mmol·L-1，誘導溫度為28 ℃，誘導時間為6 h，菌體初始濃度(OD600)為0.67；超聲波法得到含有目的蛋白的粗酶液并通過His標簽蛋白純化試劑盒經鎳親和層析純化得到純度較高的氧化亞氮還原酶蛋白，SDS-PAGE電泳檢測得到該蛋白大小約為70 kDa；通過檢測顯示重組菌E.coliBL21(DE3)-pET28b-nosZ與出發菌株Alcaligenessp.TB相比，酶活是其2.09倍，以及蛋白相對含量是其10.58倍；在酶催化反應中，當pH為7.0，溫度為40 ℃時得到最佳酶活。