外周血單核細胞PD- L2 分子在系統性紅斑狼瘡中的應用

柳毓文 劉 萍 胡 娜 葛洪亮 彭雨薇

江西省萍鄉市人民醫院風濕免疫科，江西萍鄉 337000

系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）屬于自身免疫性疾病，患者多伴有發熱、關節疼痛、蝶形紅斑等癥狀，若未得到及時治療，可能會累及多個系統，引起多種并發癥[1-2]。SLE 疾病活動指數（SLE disease activity index，SLEDAI）為臨床評估 SLE 患者病情嚴重程度的常用方法， 可將SLE 分為活動期與緩解期，但SLEDAI 容易受評估人主觀意識影響，且評估內容較多， 導致其在臨床中應用存在一定局限性。而臨床對于不同病情的SLE 患者其治療方法也不盡相同，緩解期患者經臨床積極治療后預后良好，病情容易控制，但活動期患者臨床治療難度較高，且病情復雜，極易引發狼瘡性腎炎（lupus nephritis，LN），嚴重損傷腎臟功能，影響疾病預后[3-4]。因此，采取有效的手段積極評估SLE 患者病情具有重要意義。 程序性死亡配體-1（programmed death ligand-1，PD-L1）、程序性死亡配體-2（programmed death ligand-2，PD-L2）均為程序性死亡受體1（programmed death receptor 1，PD-1）的配體，研究指出，PD-1 與其配體組成的信號途徑具有負調節免疫反應作用，且在免疫活化與耐受中具有重要作用[5]。 以往，臨床對PD-1 的配體PD-L1關注度較高，而有關PD-1 的另一個配體PD-L2 關注度較低。 基于此，本研究旨在分析外周血單核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）的 PD-L2 分子在SLE 中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析 2019 年 1 月至 2020 年 1 月萍鄉市人民醫院收治的 30 例 SLE 患者臨床資料，將SLEDAI[6]評分＞5 分的15 例活動期狼瘡性腎炎患者納入活動期組，將SLEDAI 評分≤5 分的15 例緩解期狼瘡患者納入緩解期組，并選取同期于萍鄉市人民醫院接受治療的10 例類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）患者作為活動期陽性對照病例納入RA 組及接受體檢的10 例健康志愿者納入正常對照組。 活動期組中，男 3 例，女 12 例；年齡 46~74 歲，平均（58.69±2.36）歲；病程 2~6 個月，平均（4.04±0.52）個月；體重指數（body mass index，BMI） 21~27 kg/m2，平均（22.89±1.25）kg/m2。 緩解期組中，男 5 例，女 10 例；年齡 46~75 歲，平均（58.73±2.08）歲；病程 2~6 個月，平均（4.02±0.55） 個月；BMI I21~27 kg/m2， 平均 （22.92±1.19）kg/m2。RA 組中，男 4 例，女 6 例；年齡 44~72 歲，平均（58.91±2.15）歲；病程 1~5 個月，平均（4.03±0.32）個月；BMI 22~27 kg/m2，平均（23.10±1.06）kg/m2。 正常對照組中，男 6 例，女 4 例；年齡 45~73 歲，平均（59.02±2.10）歲；BMI 21~27kg/m2，平均（22.96±1.20）kg/m2。 納入標準：①患者符合《系統性紅斑狼瘡診斷及治療指南》[7]內相關診斷標準，LN：尿蛋白定量＞0.5 g/d；②年齡18~75 歲者；③活動期組患者未用過激素和免疫抑制劑或停藥后復發。 排除標準：①妊娠期或哺乳期婦女；②伴有其他系統性結締組織病者；③合并腫瘤性疾病者。 四組患者性別、年齡、BMI 比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。 本研究經萍鄉市人民醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 方法

PBMC 的PD-L2 分子表達水平檢測：①實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，Real-time PCR） 檢測 PDL2 分子表達水平方法如下： 應用淋巴細胞分層液（Ficoll）梯度分離 PBMC，使用 TRIzol 抽提 PBMC 中總 RNA（TaKaRa，大連），Oligo-dT 反轉錄為 cDNA 后置于-20oC 下備用。 內參引物為 β-actin，序列為：正向 5′-ATCTGCCACCACACCTTCTACC-3′； 反向 5′-GATAGCACAGCCTGGATAGCAA3′。 PD-L2 引物序列為：正向 5′-GTCAGATGGAACCCAGGACC-3′；反向5′-TAGGCTCCAGAGGTGAGTCC-3′。 Real-time PCR使用德國QIGEN 公司提供的SYBR，采用PCR 兩步法進行試驗，具體為 60℃、30 s，90℃、10 s，45 個循環，結果應用循環閾值（cycle threshold，CT）表示，基因表達量為目的基因PD-L2 的CT 值-內參引物CT 值得到的△CT。 ②流式細胞術檢測PD-L2 分子表達水平方法如下： 使用流式細胞術評估外周血T 細胞、B 細胞與PBMC 中 PD-L2 的表達。 使用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline solution，PBS） 對方法①中得到的PBMC 進行洗滌， 并制成1×106單細胞懸液，提取50 μl 單細胞混懸液與3 μl 德國美天旎公司提供的異硫氰酸熒光素標記CD14 抗體及美國BD 公司提供的抗原呈遞細胞標記PD-L2 抗體共孕0.5 h，經PBS 洗滌后避光保存待檢，使用美國BD 公司提供的Accuri C6 型流式細胞儀進行檢測。

1.3 觀察指標及評價標準

記錄患者PD-L2 分子表達水平、比較各組PD-L2分子表達水平、分析SLEDAI 評分與PD-L2 分子表達水平的相關性、 及PD-L2 分子對SLE 患者病情活動程度的預測價值。 ①記錄不同性別、年齡、體重患者PD-L2 分子表達水平。 ②比較四組患者PD-L2 分子表達水平。 ③分析SLE 患者SLEDAI 評分與PD-L2分子表達水平的相關性。 ④分析PD-L2 分子表達水平對SLE 患者病情活動程度的預測價值。

1.4 統計學方法

采用SPSS 21.0 統計學軟件進行數據分析， 計量資料用均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t 檢驗；計數資料用率表示， 組間比較采用 χ2檢驗；SLEDAI 評分與PD-L2 分子表達水平的相關性分析采用Pearson 相關性檢驗；繪制受試者工作曲線（receiver operating curve，ROC），得到曲線下面積（area under the curve，AUC），分析PD-L2 分子表達水平對SLE 患者病情嚴重程度的預測價值，以P＜0.05 為差異存在統計學意義。

2 結果

2.1 不同性別、年齡、體重SLE 患者PD-L2 分子表達水平的比較

不同性別、年齡、體重的SLE 患者PD-L2 分子表達水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）（表 1）。

表1 不同性別、年齡、體重SLE 患者PD-L2 分子表達水平的比較（）

表1 不同性別、年齡、體重SLE 患者PD-L2 分子表達水平的比較（）

組別 例數 PD-L2 t 值 P 值性別（例）0.6880.497男女8 22 10.26±2.13 10.85±2.06年齡（歲）＜60≥60體重（kg/m2）＜24≥24 0.9280.361 23 7 11.03±1.89 11.74±1.25 0.1190.906 21 9 10.11±1.76 10.03±1.49

2.2 四組患者PD-L2 分子表達水平的比較

活動期組PD-L2 分子表達水平高于緩解期組與正常對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；活動期組PD-L2 分子表達水平與RA 組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）（表 2）。

表2 四組患者PD-L2 分子表達水平的比較（%，）

表2 四組患者PD-L2 分子表達水平的比較（%，）

與活動期比較，aP＜0.05

組別 例數 PD-L2活動期組緩解期組RA 組正常對照組F 值P 值15 15 10 10 14.02±3.12 9.79±1.02a 17.02±4.36 6.16±1.05a 33.502＜0.001

2.3 SLE 患者SLEDAI 評分與PD-L2 分子表達水平的相關性分析

活動期組患者 SLEDAI 評分為（8.45±2.13）分，緩解期組患者 SLEDAI 評分為（3.01±0.54）分。 經 Pearson 相關性分析發現，SLE 患者SLEDAI 評分與 PDL2 分子表達水平呈正相關（r=0.946，P=0.000）。

2.4 PD-L2 分子表達水平對SLE 患者病情活動程度的預測價值

將SLE 患者病情活動程度作為狀態變量（1=活動期，0=緩解期）， 將PD-L2 分子表達水平作為檢驗變量，繪制 ROC 曲線（圖 1），結果顯示，PD-L2 分子表達水平預測SLE 患者處于活動期的 AUC 為0.820，AUC 的 95%置信區間為 0.662~0.978， 標準誤為0.081，P 值為 0.003，最佳閾值為12.17%，靈敏度為0.800，特異度為0.800，約登指數為0.600，具有較高的預測價值。

圖1 PD-L2 分子表達水平對SLE 患者病情活動程度的預測價值的ROC 曲線圖

3 討論

SLE 發生后可能會累及腎臟、血液、呼吸道、淋巴等臟器與系統，以腎臟損傷最為常見，且該疾病發生與發展均與免疫功能紊亂有關，并且免疫功能情況與疾病活動情況及器官損傷具有密切聯系[8]。 而PBMC的PD-L2 分子表達與免疫功能有關[9]。

已有大量研究顯示，SLE 患者 PBMC 中 PD-1、PD-L1 表達異常，且提出PD-1 受體表達降低會嚴重影響機體免疫耐受功能， 進而生成大量自身抗體，而關于PD-1 另一個配體PD-L2 在SLE 患者中的生物學功能機制尚未明確[10-12]。本研究結果顯示，活動期組PD-L2 分子表達水平高于緩解期組與正常對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；活動期組 PD-L2 分子表達水平與 RA 組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。 經Pearson 相關性分析發現，SLE 患者 SLEDAI 評分與PD-L2 分子表達水平呈正相關（r=0.946，P=0.000），提示PBMC 的PD-L2 分子表達水平可能與SLE 患者病情活動程度存在一定關聯，且表現為正相關。 分析其原因為，PD-1/PD-L 為CD28/B7 家族重要成員，可通過抑制T 細胞活化與增殖發揮調控免疫應答作用，而近年來，也有研究指出其對T 細胞活化也具有一定作用[13-14]。已有研究發現，一系列正性與負性刺激信號共同介導了T 細胞活化， 而PD-L2 分子是一種重要的負性共刺激分子，故其對T 細胞活化也可能具有一定作用[15-16]。 根據上述研究結果，本研究推測，PD-L2 分子高表達可能是SLE 患者病情嚴重程度的預測因子。為證實這一推測，最后繪制ROC 曲線，結果顯示，PD-L2 分子表達水平預測SLE 患者處于活動期的AUC 為0.820，具有較高的預測價值，表明PD-L2 可作為SLE 患者病情嚴重程度的預測因子。 鑒于本研究樣本量較少，若條件允許，后期工作可進一步擴大樣本來以證實本研究結果，此工作可能為探索PD-L2分子生物學功能， 為研究SLE 發病機制及預后評估中提供參考依據。

綜上所述，PBMC 的PD-L2 分子表達水平與SLE患者病情活動程度密切相關，臨床可通過檢測PBMC的PD-L2 分子表達水平及時評估SLE 患者病情狀況，以制定有效的治療方案。