乳酸與抗菌肽Pardaxin-4對水產革蘭氏陰性病原菌的共同抑制作用

羅云龍 陳淑怡 王洋 白東清

摘要：本研究選用重要的水產革蘭氏陰性病原菌——嗜水氣單胞菌ATCC35654、CICC10500與副溶血弧菌ATCC17802為指示菌，利用比濁法進行試驗，以OD600值為判斷標準，篩選出抑菌能力較強的Pardaxin-4作為抑菌劑，探討其與乳酸共同抑菌作用的量效關系。結果發現：低濃度的Pardaxin-4可以協同乳酸抑制嗜水氣單胞菌CICC10500的生長。當Pardaxin-4濃度為30 μmol/L、乳酸濃度為5.5 mmol/L時對指示菌能產生相加抑菌作用，12 h致死率達到88%。研究結果可為魚源抗菌肽和乳酸在水產養殖中對抗革蘭氏陰性病原菌的應用以及水產品的保鮮提供理論依據。

關鍵詞：乳酸;抗菌肽;共同抑制;水產養殖

抗菌肽是一類由生物細胞特定基因編碼產生的小分子肽，具有高效的抑菌活性和較高的穩定性[1]。然而，革蘭氏陰性菌外膜（OM）作為細菌的滲透屏障，具有一定的保護作用，使革蘭氏陰性菌對抗菌肽存在天然抗性。研究認為，外膜通透劑乳酸具有增強革蘭氏陰性菌外膜通透性的作用[2]。基于此，本試驗將乳酸與幾種魚源抗菌肽聯合使用，共同處理革蘭氏陰性菌，從而篩選出較為有效的抗菌肽與乳酸組合并評估其抑菌效果。本研究能夠為水產養殖業中抗菌藥物的開發與應用提供新思路，也能夠為革蘭氏陰性菌疾病的治療與水產品的保鮮提供理論依據。

1. 材料與方法

1.1指示菌與抗菌肽

嗜水氣單胞菌ATCC35654、CICC10500、副溶血弧菌ATCC17802購自中科質檢有限公司。魚源抗菌肽Moronecidin、Misgurin、Pardaxin-4（Pard-4）通過固相合成法制備，純度大于96%。

1.2試驗方法

1.2.1抗菌肽篩選

將培養至對數期的嗜水氣單胞菌ATCC35654、CICC10500、副溶血弧菌ATCC17802菌液接種于LB液體培養基，使活菌數為1×107 CFU/mL，分別加入不同終濃度（10、50 μmol/L）的抗菌肽。采用96孔板法測定菌液的OD600值[3]。

1.2.2乳酸與抗菌肽對革蘭氏陰性水產病原菌生長的協同抑制作用

以嗜水氣單胞菌ATCC35654、CICC10500為指示菌，測定乳酸與抗菌肽對指示菌的部分最低致死濃度。分別以活菌數為1×107 CFU/mL的菌液作為對照組;以乳酸（終濃度為5.5 mmol/L）處理為乳酸處理組;添加不同濃度抗菌肽（終濃度為20、30、40 μmol/L）為抗菌肽處理組;添加不同濃度的乳酸+抗菌肽為共同處理組。每組設三個平行。于30 ℃培養12 h后測OD600值。

各試驗組于4 ℃處理0、4、8、12 h后離心（4 ℃，1600 g），棄上清并用無菌生理鹽水重懸。使用平板計數培養基，以傾注法倒平板，于30 ℃培養12 h后通過平板計數法計算菌落數量[4]。

2 結果與分析

2.1 數據分析方法

本研究所有數據均用Excel 2003、ORIGIN 8、SPSS 13.0進行分析處理。利用Excel軟件計算得出各組數據的標準偏差;利用ORIGIN 8軟件繪圖;利用SPSS軟件進行方差分析，結果均以平均值±標準差表示，每個指標設置三個重復。

2.2 結果與分析

2.2.1抗菌肽的初步篩選

選用魚源抗菌肽Moronecidin、Misgurin、Pardaxin-4作為抑菌劑，考察其對水產革蘭氏陰性病原菌的抑制作用。抗菌肽濃度為10 μmol/L時，與對照組相比，Pardaxin-4單獨處理組對指示菌嗜水氣單胞菌ATCC35654、CICC10500、副溶血弧菌ATCC17802的生長有明顯抑制作用，生長抑制率分別為14.4%、9.7%、14.7%;Moronecidin、Misgurin單獨處理組對嗜水氣單胞菌ATCC35654 、副溶血弧菌ATCC17802的生長有明顯抑制作用，對嗜水氣單胞菌CICC10500的生長有促進作用。隨著濃度增加（50 μmol/L），以上抗菌肽對嗜水氣單胞菌ATCC35654、副溶血弧菌ATCC17802的抑制作用降低，對嗜水氣單胞菌CICC10500的抑制作用升高。總體而言，抗菌肽Pardaxin-4對所有指示菌的生長均有抑制作用，抑菌能力較強。

2.2.2 抗菌肽的選定與最小抑制濃度的確定

進一步篩選乳酸與Pardaxin-4協同的適宜濃度范圍。對于嗜水氣單胞菌ATCC35654、副溶血弧菌ATCC17802來說，不同濃度的Pard-4（10、20、30、40 μmol/L）與乳酸（5.5 mmol/L）共同處理對抑菌效果沒有明顯提升。各濃度Pard-4與乳酸的共同處理組與乳酸單獨處理組均降低了指示菌的OD600值，對指示菌有一定的生長抑制作用，但是兩組間OD600值沒有顯著差異，無法排除共同處理組的抑菌作用完全由乳酸造成的可能。

對于嗜水氣單胞菌CICC10500，不同濃度Pard-4與乳酸的共同處理組與乳酸單獨處理組均降低了指示菌的OD600值，對指示菌有生長抑制作用。其中，Pard-4與乳酸的共同處理組OD600值顯著低于乳酸單獨處理組，二者對嗜水氣單胞菌CICC10500具有協同抑菌效果。在Pard-4與乳酸的共同處理組中，當Pard-4濃度達到30、40 μmol/L時，指示菌的OD600值降至最低且不再隨抗菌肽濃度升高而改變。因此，在與5.5 mmol/L乳酸聯合使用下，對嗜水氣單胞菌CICC10500有協同抑菌效果的Pard-4的最小抑菌濃度為30 μmol/L。

2.2.3乳酸與Pard-4對革蘭氏陰性水產病原菌的協同致死濃度

以嗜水氣單胞菌CICC10500為指示菌，檢測細菌在Pard-4與乳酸協同處理下的活菌數。在Pard-4與乳酸協同處理下，指示菌的活菌數量隨處理時間延長而減少。乳酸單獨處理12 h對嗜水氣單胞菌CICC10500的致死率為72%，Pard-4與乳酸共同處理12 h后嗜水氣單胞菌CICC10500的死亡率為88%。

3 討論

本研究發現Pardaxin-4單獨處理時對三種指示菌均有生長抑制作用，這可能是源于它對細菌膜的成孔活性[5]。試驗顯示，Pardaxin-4濃度升高時對指示菌嗜水氣單胞菌ATCC35654、副溶血弧菌ATCC17802的生長抑制作用減弱，此現象的機理尚未明確;推測該抗菌肽可能是菌體生長的營養物質或影響菌體代謝的信息遞質，從而促進細菌生長。單獨低濃度乳酸處理對嗜水氣單胞菌具有一定的生長抑制作用。當以Pardaxin-4與乳酸共同處理嗜水氣單胞菌CICC10500時，菌體的生長進一步受到抑制，致死率顯著升高。

參考文獻：

[1]唐馨， 毛新芳， 馬彬云， et al. 抗菌肽的研究現狀和挑戰 [J]. 中國生物工程雜志， 2019， v.39;No.329（08）： 92-100.

[2]ALAKOMI H-L， SKYTTA E， SAARELA M， et al. Lactic acid permeabilizes gram-negative bacteria by disrupting the outer membrane [J]. Applied and environmental microbiology， 2000， 66（5）： 2001-5.

[3]馬歡歡， 林洋， 呂欣然， et al. 96孔板法篩選抗黑曲霉性乳酸菌及抑菌機理研究 [J]. 食品工業科技， 2017， 38（012）： 171-5.

[4]丁華， 王建清， 王玉峰， et al. 羅勒精油和Nisin復配抑菌劑抑菌效果的研究 [J]. 中國調味品，

[5]LAZAROVICI P， PRIMOR N， LOEW L M. Purification and pore-forming activity of two hydrophobic polypeptides from the secretion of the Red Sea Moses sole （Pardachirus marmoratus） [J]. Journal of Biological Chemistry， 1986， 261（35）： 16704-13.