高效液相色譜法測定有機-無機復合肥料中4種抗生素的含量

鄧 帆，龔 寧

(貴州省產品質量檢驗檢測院 貴州貴陽 550014)

為了防止畜禽在生長過程中遭受病毒的感染，飼養場經常使用抗生素進行預防，但畜禽對抗生素不能完全吸收，無法吸收的抗生素便通過糞便排放了到自然環境中。有資料顯示[1]，有機-無機復合肥料中有機組分主要為雞糞、豬糞、牛糞、羊糞等畜禽糞污。飼養場中常用的抗生素主要有氨基糖胺類、四環素類、氯霉素類、多肽類等。如果長期施用含抗生素的有機-無機復合肥料，將會威脅土壤、水體和農產品的質量安全；人如果長期食用含有抗生素的產品，有可能會傷害人體的血液系統、腎臟、肝臟、心臟等，還會滅殺人體正常菌群，誘發耐藥菌的產生。四環素類抗生素使用廣泛，檢出率較高，且常同時檢出多種化合物。因此，對有機-無機復合肥料中四環素類抗生素含量的精準檢測，在防止污染原料的非預期使用、避免環境污染、促進有機-無機復合肥料生產和糞肥還田、確保糧食安全和提高農產品品質等方面具有重要作用。

1 試驗部分

1.1 試驗原理

試樣中的四環素類抗生素用乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)-Mcllvaine-甲醇提取液振蕩，離心提取，再通過氮吹儀濃縮，經固相萃取柱凈化，濃縮、定容后，用高效液相色譜法進行測定，通過與保留時間比較進行定性，外標法定量。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑

抗生素混合標準儲備液：1 mg/mL。

甲醇(CH3OH)、乙腈(C2H3N)為色譜純，德國默克公司；磷酸二氫鈉(NaH2PO4)、EDTA(C10H14N2Na2O8)、水合草酸(C2H2O4·2H2O)、檸檬酸(C6H8O7)為分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

EDTA溶液：稱取EDTA 37.22 g，用水定容至1 000 mL，此溶液物質的量濃度為0.1 mol/L。

Mcllvaine溶液：0.4 mol/L磷酸二氫鉀溶液1 000 mL與0.2 mol/L檸檬酸溶液294 mL混合，搖勻。

EDTA-Mcllvaine-甲醇提取液：移取EDTA溶液、Mcllvaine溶液、甲醇按體積比1∶1∶2混合，用氫氧化鈉或鹽酸調節pH為中性。

1.2.2 儀器

安捷倫1260型高效液相色譜儀，配備紫外檢測器、二極管陣列檢測器，安捷倫科技有限公司；TDL-40B型離心機，上海安亭科學儀器廠；SHA-BA型機械振蕩提取儀，上海巨納科技有限公司；Turbo Vap Lv型氮吹儀，美國Caliper公司。

1.3 標準溶液系列的配制

標準溶液：移取1 mg/mL的4種抗生素混合標準儲備溶液10.00 mL定容至100 mL，配成質量濃度為100 μg/mL的標準溶液。

標準溶液系列：移取標準溶液0.50、1.00、2.00、5.00、10.00、20.00 mL至100 mL容量瓶中，用EDTA-Mcllvaine-甲醇提取液定容，搖勻，配成質量濃度分別為0.50、1.00、2.00、5.00、10.00、20.00 μg/mL的標準溶液系列。

1.4 樣品的制備

1.4.1 目標物的提取

準確稱取1～2 g(精確至0.1 mg)樣品于50 mL棕色離心管中，加入EDTA-Mcllvaine-甲醇提取液20 mL，于機械振蕩提取儀提取20 min(室溫，約25 ℃)，將離心管取出置于離心機上，以轉速4 500 r/min離心10 min，離心后將上層溶液轉移至50 mL容量瓶中；離心管中殘渣依次用20、10 mL EDTA-Mcllvaine-甲醇提取液重復上述步驟提取2次,合并上清液并定容至50 mL，待凈化處理。

1.4.2 固相萃取裝置凈化

準確移取上清液5.00 mL置于氮吹儀上，室溫(約25 ℃)吹至原體積的一半左右；加適量水稀釋至體積約5 mL，以1 mL/min的速率通過已活化處理的固相萃取柱，依次用5 mL水、5 mL甲醇-水溶液淋洗固相萃取柱，減壓抽干5 min；用5 mL草酸-甲醇溶液洗脫目標物，洗脫液用飽和NaOH溶液調至pH為5～6，置于氮吹儀吹至近干；用1 mL水溶解殘渣，過0.22 μm的濾膜，待測[2]。

1.5 色譜條件

色譜柱：EC-C18柱，2.7 μm，3.0 mm×50 mm。

流速：0.8 mL/min。

柱溫：色譜柱左右兩端溫度均為30 ℃。

進樣量：20 μL。

檢測波長：355 nm。

流動相A為甲醇-乙腈(1+1)溶液，流動相B為0.01 mol/L草酸溶液，梯度洗脫條件見表1。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的選擇

按照文獻[3]中流動相條件進行試驗，結果表明，流動相A為甲醇-乙腈(1+1)溶液，流動相B為0.01 mol/L草酸溶液時，可實現色譜峰的基線分離。20 μg/mL的4種抗生素混合標準溶液的色譜圖見圖1。

2.2 標準曲線與檢出限

按色譜條件測定4種抗生素混合標準溶液系列，以抗生素的質量濃度為橫坐標，其對應的峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得到4種抗生素的線性回歸方程和相關系數，結果見表2。以3倍信噪比(S/N)計算4種抗生素的檢出限[4]，結果見表2。

由表2可知，4種抗生素的質量濃度在0.1～20.0 μg/mL范圍內呈線性，相關系數均不小于0.999 8，檢出限為0.75～1.0 mg/kg。

2.3 精密度和回收試驗

空白樣品中添加1 mg/kg的4種抗生素混合標準溶液的色譜圖見圖2。在選定的試驗條件下，取已知4種抗生素含量的同一樣品3份，分別添加1、5、10 mg/kg的4種抗生素混合標準溶液進行加標回收試驗，每個加標水平重復測定3次，計算回收率和相對標準偏差(RSD)，結果見表3。

表3 精密度和回收試驗結果 %

由表3可知，加標回收率為96.7%～104%，RSD為1.6%～2.7%，表明方法穩定，具有較高的精密度和較好的回收率。

3 結語

試驗采用EC-C18色譜柱進行分離，二極管陣列檢測器檢測，以外標法定量，高效液相色譜法測定有機-無機復合肥料中4種抗生素的殘留量。方法具有靈敏度高、準確度高、精密度好等優點，可以滿足有機-無機復合肥料中4種抗生素的檢測需求。