CFTR基因多態性與原發性肝內膽管結石發病風險的關系

梅 璇， 吳海聰， 林 靜， 鄭嬌龍， 劉 邦， 李東良

解放軍聯勤保障部隊第九〇〇醫院(福建醫科大學福總臨床醫學院) 肝膽內科， 福州 350025

原發性肝內膽管結石(primary intrahepatic lithiasis，PIL)是指發生于左右肝管分叉部以上的肝內各級分支膽管內的結石，屬于原發性膽管結石的一種[1]。肝內膽管解剖結構的復雜性及結石大小、數量的多樣性，易誘發反復膽道感染，長期發展可繼發膽汁性肝硬化以及膽管癌等嚴重并發癥，嚴重影響患者的生活和生存質量[2]。由于其發病機制尚未完全闡明，迄今仍缺乏滿意的治療藥物和有效的預防方法[3]。流行病學研究[4]顯示，不同種族、不同國家和地區人群該病發病率存在較大差異，這一現象提示PIL具有遺傳易感性。因此，對易感基因篩查和功能研究已成為近年來關于PIL研究的一個重要方向。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2018年6月—2018年11月于本院門診或住院的PIL患者作為病例組，并篩選同期健康體檢者作為對照組。納入標準：病例組患者診斷標準符合2016年《歐洲肝病學會臨床實踐指南：膽石病的預防、診斷和治療》[11]。對照組為與病例組無血緣關系的非PIL的健康體檢者。排除標準：(1)排除進行性家族性肝內膽汁淤積癥、良性再發型肝內膽汁淤積癥、妊娠期肝內膽汁淤積癥等相關膽汁淤積性疾病；(2)排除膽囊結石及肝外膽管結石患者；(3)排除病毒性肝病(包括 HAV、HBV、HCV、EBV、CMV 和單純皰疹病毒感染)；(4)排除有嚴重免疫缺陷者；(5)與已入組的病例或對照人群有親緣關系者；(6)臨床資料不完整的病例。

1.2 資料收集 用EDTAK2抗凝管收集研究對象外周血4 mL用于基因組DNA提取。資料采集內容包括：研究對象基本資料，肝內膽管結石情況，影像學檢查結果，診療方法及療效，既往病史等信息。

1.3 實驗方法

1.3.1 主要試劑和儀器 2xTaq Master Mix(美國Vazyme公司)；引物(上海擎科生物工程有限公司)；基因組DNA提取試劑盒(美國omega公司)；臺式高速離心機(德國 Eppendorf 公司)；ND-1000 紫外分光光度計(上海譜元儀器有限公司)；PCR 9700型擴增儀(美國ABI公司)；電泳儀(上海Tanon公司)；凝膠成像儀(上海Tanon公司)；3730XL測序儀(美國ABI公司)。

1.3.2 基因組DNA提取 采用美國omega公司的基因組DNA提取試劑盒，按照操作說明書提取外周血細胞中的基因組DNA，具體步驟參照產品說明書。應用紫外分光光度法對提取的基因組DNA的濃度及純度進行測定。

1.3.3 基因位點的選擇 以 CFTR基因作為本研究的目的基因，從Pubmed數據庫中的文獻、UCSC數據庫中篩選并確定在國人中與疾病密切相關的Poly-T、TG-repeats和M470V位點為目標位點。

1.3.4 基因型鑒定 利用UCSC人類基因組數據庫的In-Silico PCR工具確定引物序列(表1)。上海擎科生物工程有限公司進行引物合成及目標位點PCR擴增。將擴增產物送至上海歐易生物科技公司進行測序。

表1 CFTR基因3個位點正反向引物

1.4 倫理學審查 本研究通過解放軍聯勤保障部隊第九〇〇醫院倫理委員會批準，批號：2018-021，所有研究對象均簽屬知情同意書。

2 結果

2.1 一般資料 共納入PIL患者104例，男34例，女70例，平均(59.32±14.35)歲。對照組120例，男72例，女48例，平均(48.47±12.65)歲。2組研究對象年齡、性別差異均有統計學意義(P值均<0.05)(表2)。

2.2 Hardy-Weinberg 平衡檢驗 PIL組3個位點及對照組TG-repeat、Poly-T位點基因型頻率均符合Hardy-Weinberg平衡(P值均>0.05)。對照組M470V位點上基因型頻率偏離Hardy-Weinberg 平衡(χ2=17.59，P<0.05)。

因此，采用ORadj表示基因型與發病風險的關系。經平衡校正后，攜帶有等位基因G的個體(AG、GG)較AA純合型個體發生PIL的風險升高(OR>1)，隨著等位基因G的個數增加，患病風險逐漸升高(ORGG：4.68>ORAG：2.50)(表3)。

表2 研究對象的一般資料

表3 PIL組與對照組M470V位點基因型比較

表4 PIL組和對照組3個位點等位基因分布

表5 PIL組和對照組3個位點基因型分布

表6 PIL組和對照組TG-repeat、Poly-T多態性位點的單倍體基因型分布

2.3 CFTR基因中三個多態性位點的等位基因及基因型分布 PIL組和對照組間3個位點的基因分析結果顯示：M470V位點上的等位基因(χ2=15.139，P<0.01)和基因型(χ2=22.889，P<0.01)在2組間差異均有統計學意義。TG-repeat、Poly-T兩位點上等位基因及個體基因型在2組間差異均無統計學意義(P值均>0.05)(表4、5)。

2.4 CFTR基因多態性與PIL的關系 M470V位點上，等位基因G攜帶者的PIL發病風險升高(OR=2.108，P<0.01)(表4)。TG-repeats位點上，12TG/13TG基因型個體發生PIL的風險較11TG/12TG基因型個體升高(OR=11.002，P<0.05)。Poly-T位點上，7T/5T基因型個體發生PIL的風險較7T/7T基因型個體降低(OR=0.079，P<0.05)(表5)。

2.5 CFTR基因TG-repeat、Poly-T兩個多態性位點的單倍體基因型分析 11TG-7T、12TG-7T單倍體基因型在PIL患者當中所占比例最高，分別為45.2%和51.0%。TG-repeats和Poly-T位點的各種單倍體基因型在PIL組和對照組間頻率差異均無統計學意義(P值均>0.05)(表6)。

3 討論

此前，在其他疾病中已證實TG-repeats、Poly-T位點多態性與疾病表型相關[20]。TG-repeats是位于CFTR基因核苷酸鏈上內含子8與外顯子9之間的一段TG堿基重復序列，參與內含子8與外顯子9的剪接，TG重復序列越長，功能正常的CFTR蛋白數量越少[19]。在本研究中，12TG/13TG基因型個體的PIL易感性比11TG/12TG個體更高(OR=11.002，P<0.05)。這與Salinas等[21]在非PIL疾病研究中發現TG重復序列越長越容易致病的研究結果一致。Poly-T是與位點TG-repeats緊鄰的T堿基重復序列，堿基T重復次數越少，正常的CFTR蛋白數量越少[9]。Jiang等[22]研究認為IVS8-5T是慢性胰腺炎的危險因素。反之，Qiao等[23]卻發現5T在前列腺癌發病過程中起保護作用。在本研究中，7T/5T個體較7T/7T發生PIL的風險更低(OR=0.079,P=0.047)。不同種族及地域人群的CFTR基因多態性存在差異[4]，因此，本研究與既往部分研究結果不相符可能是由于納入的研究對象遺傳背景不同所致。

本研究目前僅局限于基因層面，尚無蛋白質分子水平的證據，即使基因異常卻仍有可能出現編碼蛋白不致病可能，因此需進一步對CFTR基因參與的信號通路及編碼的蛋白產物加以研究探索。另外，本研究為單中心研究，樣本量有限，難免存在選擇偏倚，研究結果未來還需在更大樣本量及不同種族、地域人群中進行驗證。

肝內膽管結石的發病不是單一因素所致，而是由多因素共同作用。本研究結果證實了漢族人群中CFTR基因的M470V位點和PIL易感性之間的相關性。然而目前CFTR基因多態性在PIL發病過程中的分子作用機制尚未完全明確。未來仍需進一步的研究來闡釋其多態性在PIL中的具體致病機制。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：梅璇負責課題設計、研究實施、數據分析以及論文撰寫；吳海聰、林靜負責資料收集、數據分析；鄭嬌龍、劉邦負責數據整理；李東良負責課題設計、研究指導、論文修改。