血清miR-PC-5P-12969、miR-422b、miR-221-3p在急性缺血性腦卒中的表達及意義*

王亞倩，楊 鑫，高 楊，劉 超

河北省石家莊市第三醫院檢驗科,河北石家莊 050011

腦卒中后患者病死率和致殘率較高，80%以上的腦卒中為急性缺血性腦卒中(AIS)[1]。CT和MRI是診斷AIS患者的主要方法，也是鑒別AIS與出血性腦卒中(HS)的主要手段。CT雖可準確鑒別診斷AIS和HS，但對于早期AIS，特別是6 h以內的AIS診斷較困難；MRI對發病6 h以內的病灶診斷最靈敏，但其價格較昂貴且MRI不應用于急診，因此，其診斷早期腦卒中較困難[2]。AIS最有效的治療手段是重組人組織型纖溶酶原激活劑(rtPA)溶栓治療，但其治療時間窗較狹窄，從而限制其臨床應用。因此，對于AIS的早期預測和預后評估，需要尋找有效的生物標志物。小分子核糖核酸(miRNA)是一組由20～24個核苷酸構成的非編碼、內源性單鏈RNA分子，通過調節基因表達在多種生理和病理過程中扮演重要角色，主要包括細胞增殖、代謝、免疫、炎性反應、腫瘤發生等[3]。此外，miRNA可能與神經發育及功能有關，與靶基因共同參與炎性反應、神經血管再生、腦水腫形成等與AIS相關的病理、生理過程。目前，有研究表明，miRNA可以在血漿、血清、尿液和腦脊液等多種體液中檢測到，且非常穩定，這表明其有可能作為診斷或監測治療各種疾病的生物標志物，包括AIS[4]，提示miRNA可能是AIS患者早期預測的分子標志物和有效的治療靶標。在具有差異性表達的miRNA譜中，miR-PC-5P-12969、miR-422b、miR-221-3p在發生AIS時表達最明顯[5-6]，但3項指標與AIS疾病嚴重程度的關系有待進一步研究。因此，本研究旨在探討不同嚴重程度的AIS患者血清miR-PC-5P-12969、miR-422b、miR-221-3p表達水平及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2017年1月至2020年1月本院收治的141例初診為AIS的患者作為研究組，其中：男64例，女77例；年齡51～84歲，平均(69.34±6.52)歲。納入標準：符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2018》[7]診斷標準；急性起病(24 h內)；臨床體征有局部或全身神經功能障礙；經CT灌注成像 (CTP)或磁共振成像(MRI)+擴散加權成像(DWI)檢查明確病灶。排除標準：復發性腦梗死；經計算機體層血管成像(CTA)等檢查確定為非血管性病變；頭顱CT或MRI檢查診斷為HS；嚴重心、腎功能障礙；合并惡性腫瘤及血液系統疾?。换季窦膊』虼嬖谝庾R障礙不能配合完成本研究。按照美國國立衛生研究院卒中量表(NIHSS)評分，將AIS患者分為輕度組、中度組、重度組。輕度組46例，NIHSS<5分，男19例、女27例，年齡51～79歲、平均(62.28±6.52)歲；中度組51例，5分≤NIHSS≤20分，男22例、女29例，年齡55～80歲、平均(68.05±6.52)歲；重度組44例，NIHSS>20分，男23例、女21例，年齡58～84歲、平均(71.64±6.52)歲。另外收集50例同期來本院腦血管門診就診，并最終經各種檢查確診僅為一般性心腦血管疾病，無梗死病灶，無局部或全身神經功能障礙的普通患者作為對照組，男23例、女27例，年齡54～82歲、平均(68.61±6.52)歲。收集并記錄所有研究對象的基線資料，包括性別、年齡、空腹血糖、三酰甘油、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、高血壓、糖尿病、高脂血癥、體質量指數、吸煙史、飲酒史及短暫性腦缺血發作(TIA)病史，研究組與對照組上述資料比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。本研究經本院醫學倫理委員會批準，所有患者家屬均簽署知情同意書。

表1 研究組與對照組基線資料比較[n/n或或n(%)]

組別n高血壓糖尿病高脂血癥體質量指數(kg/m2)吸煙史飲酒史TIA病史研究組14182(58.16)69(48.94)27(19.15)22.65±2.3474(52.48)41(29.08)23(16.31)對照組5031(62.00)18(36.00)14(28.00)22.91±1.8625(50.00)13(26.00)8(16.00)χ2/t0.2262.491.7151.3040.0910.1720.003P0.6350.1150.190 0.2560.7630.6780.959

1.2血清miR-PC-5P-12969、miR-422b、miR-221-3p檢測 所有研究對象均于入院當天抽取靜脈血5 mL，置于未加入抗凝劑的真空采血管中，室溫下進行離心操作，離心后吸取上層血清并加入提取劑(TRIzol)，于-80 ℃保存以備使用。按照試劑盒(安捷倫科技有限公司，加利福尼亞州，美國)說明書提取血清中總RNA，用去除基因組反轉錄試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)將待測標本反轉錄為cDNA。反轉錄體系為10 μL∶2 μL mix，≤5 00 ng RNA，加入無RNA酶水至反應溶液體積10.0 mL。采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測血清miR-PC-5P-12969、miR-422b、miR-221-3p表達水平，采用miRNA熒光定量檢測試劑盒及75200熒光定量擴增儀(北京博凌科為生物科技有限公司)檢測。PCR反應條件：95 ℃預變性2 min，再進行95 ℃變性10 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸25 s，40個循環。PCR總反應體系為20.0 μL：以SnoR-202為內參，特定正向引物1.0 μL，常用反向引物1.0 μL，2× SYBRVR Green PCR 10.0 μL，cDNA 1.0 μL，最后加入無RNA酶水至反應溶液20.0 μL。引物購自北京博凌科為生物科技有限公司。采用2-ΔΔCt法計算相對表達結果。實驗重復3次。

2 結 果

2.1各組3種血清miRNA的表達水平 輕度組、中度組、重度組AIS患者血清miR-PC-5P-12969、miR-422b、miR-221-3p表達水平均明顯低于對照組，且3項指標表達水平均隨AIS疾病的嚴重程度增加呈降低趨勢，兩兩比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組3種血清miRNA的表達水平

2.2多因素Logistic回歸分析發生AIS的危險因素 采用逐步后退多因素Logistic回歸分析，結果顯示，血清miR-PC-5P-12969、miR-422b和miR-221-3p水平降低是發生AIS的獨立危險因素(P<0.05)。見表3。

表3 多因素Logistic回歸分析發生AIS的危險因素

2.3ROC曲線分析3種血清miRNA診斷AIS的效能 ROC曲線分析結果顯示，血清miR-PC-5P-12969、miR-422b、miR-221-3p診斷AIS的AUC分別為0.815、0.756、0.771，且具有較高的特異度和靈敏度。見表4和圖1。

表4 3種血清miRNA診斷AIS的效能

圖1 3種血清miRNA診斷AIS的ROC曲線

3 討 論

AIS是腦缺血后發生的一系列病理事件，最終可導致不可逆性神經損傷，是中老年人最常見的心腦血管疾病之一。臨床癥狀主要為腦缺血壞死區域對應的神經功能缺損，診斷主要依靠詢問病史、查體和影像學檢查，部分患者早期影像學檢查未見異常表現，部分影像學檢查表現不典型，而溶栓治療時間窗在6 h以內。血液標本是最易獲得的檢測標本，血清中存在穩定的miRNA，在冠心病、腫瘤等疾病中可呈特征性表達譜[8]，目前，尚缺乏可靠的血液生物標志物預測AIS。因此，探索血清生物標志物miRNA用于AIS的診斷、預測病情變化的臨床價值具有重要意義。

miRNA參與轉錄后調控，是多種疾病的潛在生物標志物，如腫瘤、阿爾茨海默病和AIS[9]。有研究表明，miRNA是診斷AIS或判斷預后的潛在標志物[10]。另有研究表明，miRNA在AIS中扮演著重要角色，如參與動脈粥樣硬化、炎性反應、神經血管再生、細胞凋亡、腦水腫形成等[11]。特異性miRNA的異常表達通過改變靶基因表達調節缺血后神經的死亡[7]。有研究表明，miR-PC-5P-12969通過抑制顱內血管miRNA的翻譯，使淀粉樣蛋白表達減少，誘發AIS；腦血管動脈粥樣硬化的斑塊脫落、血管堵塞，發生腦卒中，導致腦組織中miR-PC-5P-12969表達上調，但外周血中的miR-PC-5P-12969表達降低[12]。細胞實驗顯示，在AIS誘導的HT22細胞中miR-PC-5P-12969表達水平升高了兩倍。動物實驗顯示，小鼠大腦皮層的miR-PC-5P-12969水平在AIS后4 h和1 d內明顯升高，且正常腦組織中miR-PC-5P-12969表達在觀察時間內呈低表達,且表達量沒有明顯改變[12]。VIJAYAN 等[5]的研究表明，miR-PC-5P-12969僅在缺血狀態下才表達，可作為AIS特異性生物標志物。

miR-422b最初在HL-60白血病細胞中被發現，通過調控細胞PGC1β蛋白表達調節細胞與機體的氧化代謝[12]。筆者推測在AIS患者中，因腦組織缺血缺氧，導致氧化代謝水平降低，從而使PGC1β蛋白表達減少，進一步導致血清miR-422b表達水平降低。miR-221前體的3′端加工即為miR-221-3p。miR-221-3p在血管平滑肌細胞和血管內皮細胞中呈高表達[13]。血管損傷、血管平滑肌細胞的增殖和新生內膜的生長導致血管平滑肌細胞中miR-221-3p表達上調[14]，在動脈粥樣硬化患者的血管內皮細胞中miR-221-3p表達上調[15]。AIS主要表現為頸部和顱內動脈血管粥樣硬化、血管損傷，血管中miR-221-3p表達上調，導致血清中miR-221-3p表達降低。WANG等[6]研究顯示，AIS患者血清miR-221-3p和miR-382-5p水平明顯低于健康對照者。本研究結果顯示，3組AIS患者3種血清miRNA表達均明顯低于對照組，隨著神經功能缺損的加重，AIS的3種miRNA表達呈明顯的降低趨勢(P<0.05)。表明AIS患者血清miRNA表達降低，且神經功能缺損越嚴重的患者，血清miRNA水平越低，因此，3種血清miRNA可能是診斷AIS發生及判斷AIS病情嚴重程度的潛在指標。

本研究多因素Logistic回歸分析發現，血清miR-PC-5P-12969、miR-422b和miR-221-3p水平降低是發生AIS的獨立危險因素。ROC曲線分析顯示，血清miR-PC-5P-12969、miR-422b和miR-221-3p水平對AIS的診斷具有較高的特異度和靈敏度，與以往研究結論一致[5-6]。

本研究存在的主要問題：樣本相對較少，只是一個研究中心的結果；沒有做3種miRNA與AIS療效、預后的相關性探討；3種miRNA定量平臺無標準化處理流程，特別是引物序列、內參及試劑比例與操作方案的標準化，檢測結果的重復性與可靠性有待商榷。因此，未來的研究需先建立標準化的檢測方法，然后在可獲得穩定檢測結果的情況下，調查健康人群的參考范圍，再研究指標與疾病發生發展、治療效果和預后的關系，使檢測結果可在臨床中使用。

綜上所述，血清miR-PC-5P-12969、miR-422b和miR-221-3p在AIS患者中表達降低，其表達水平隨著AIS疾病嚴重程度增加而呈降低趨勢，3項指標降低均為發生AIS的獨立危險因素，是早期診斷AIS、判斷AIS嚴重程度的潛在血清學標志物。