肝外膽管癌患者腸道菌群變化分析

李 濤， 王盼梁， 袁梓博， 馮泉凱， 李 捷

1 鄭州大學第一附屬醫院 肝膽胰外科， 鄭州 450052； 2 河南省消化器官移植重點實驗室， 鄭州 450052；3 鄭州市器官移植技術與應用工程重點實驗室， 鄭州 450052

膽管癌是一種源于膽道上皮的惡性腫瘤，根據解剖位置不同，膽管癌分為肝內膽管癌和肝外膽管癌(extrahepatic cholangiocarcinoma,ECC)。近幾十年，全球ECC的發病率不斷上升[1]。寄生蟲感染、原發性硬化性膽管炎(PSC)、膽管囊腫和結石是ECC發生的危險因素[2]。腸道菌群占人體所有共生微生物的絕大多數，其種類超過1000種，細胞總數約1014，是人體自身細胞數量的10倍[3]，對機體代謝、免疫等功能具有重要的調節作用[4]。體內外各種有害刺激因素都會導致腸道菌群發生紊亂，對機體產生嚴重損害。腸道菌群紊亂與慢性肝病、肝硬化和肝癌的形成發展密切相關，被形象地稱為“腸-肝”軸[5-6]。本研究擬通過菌群16S rRNA絕對定量測序分析ECC患者腸道菌群變化，從菌群角度為ECC診斷和治療提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2020年1月—2020年12月于鄭州大學第一附屬醫院肝膽胰外科住院治療的ECC患者16例(ECC組)，診斷符合2020年美國國立綜合癌癥網絡肝膽腫瘤臨床實踐指南(V1版)[7]標準；膽總管結石(common bile duct stones,CBDS)患者20例(CBDS組)，診斷符合2017年膽總管結石管理指南[8]；同期在本院體檢的健康成人10例(Normal組)。排除標準：(1)ECC組排除肝內膽管癌、肝癌患者；確診為ECC但是以往接受過手術或介入治療的患者。(2)CBDS組排除膽囊結石和肝內膽管結石患者。(3)有其他惡性腫瘤；信息不完全；濫用酒精；既往消化道疾病史或消化道手術史；免疫系統疾病以及其他與腸道菌群相關的疾病(如炎癥性腸病、糖尿病)。

1.2 樣品采集及DNA提取 晨起后排便于無菌容器，使用一次性采集勺取適量樣品于無菌采集管中，置于冰盒中迅速送至實驗室，分裝后置于-80 ℃冰箱保存，保存時間小于1個月。按QIAamp?Fast DNA Stool Mini Kit(Germany, Qiagen)說明書提取糞便菌群總DNA，NanoDrop2000(USA, Thermo Fisher Scientific)檢測DNA濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性。

1.3 16S rRNA可變區擴增及測序 選取16S rRNA V3-V4可變區進行PCR擴增，引物為F(5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)和R(5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′)。利用帶有Index序列的引物，通過高保真PCR向文庫末端引入特異性標簽序列，經純化后(Agencourt AMPure XP，USA)，得到原始文庫。再利用Invitrogen對文庫進行精確定量(Qubit 3.0，USA)，根據不同樣本的測序通量要求，按相應摩爾比混合樣本。使用生物分析儀(Agilent 2100，USA)評估DNA文庫的質量和檢測插入物的大小，所有樣品插入物的大小在120～200 bp。合格后通過使用Illumina NovaSeq(Illumina，USA)臺式序列儀，用2×250 bp配對末端方法進行16S rRNA基因擴增子的測序。

1.4 數據信息分析 首先對原始下機數據進行質控和過濾(QIIME2，2019.10)，使用優化的有效序列進行ASVs(Amplicon sequence variants)分類分析。標記spike-in序列，并統計各個樣本spike-in序列比例。根據每個樣本spike-in序列數和拷貝數信息制作標準曲線方程，計算得到每個樣本中各個ASVs的絕對拷貝數(不含spike-in序列)。ASVs的分類學物種注釋，默認使用RDP數據庫(https://rrndb.umms.med.umich.edu/)。Alpha多樣性分析使用MOTHUR軟件進行，群落組成分析使用MOTHUR和R軟件完成。Beta多樣性分析和組間顯著差異的物種，主要使用R和Lefse軟件完成。差異菌群與環境因子的相關性分析采用Spearman分析。

1.5 倫理學審查 本研究經鄭州大學第一附屬醫院倫理委員會批準，批號： 2020-KY-369，患者及家屬均簽署知情同意書。

2 結果

2.1 一般資料 ECC組TBil、DBil、ALP和GGT明顯高于CBDS組(P值均<0.05)。在藥物使用方面，ECC組使用過或正在使用抑酸藥、保肝藥和抗生素的例數分別為4例、4例、3例，與CBDS組(7例、10例、9例)比較，差異均無統計學意義(P值均>0.05)，ECC組使用抑酸藥、保肝藥和抗生素的天數與CBDS組相比差異均無統計學意義(P值均>0.05)。另外，ECC組有2例接受過經皮肝穿刺膽道引流術(percutaneous transhepatic cholangial drainage,PTCD)減黃。ECC組與Normal組比較，肝功能指標差異均有統計學意義(P值均<0.05)(表1)。

2.2 測序深度評估 分別從樣本中隨機抽取出一部分序列，以抽到的序列數與它們所能代表ASVs的數目構建稀釋性曲線?？梢娗€隨著抽取序列數的增加而趨于平緩，說明樣本的測序數據量合理, 足以覆蓋大多數微生物(圖1)。

2.3 腸道菌群多樣性分析 多樣性是描述樣本物種總數和多樣性的指標，主要包括 Observed species、Chao1指數、Shannon指數、ACE指數和Simpson指數。Observed species顯示3組間物種總數未發生明顯變化，Chao1指數和ACE指數顯示3組間物種多樣性無明顯差異，而 Shannon指數和Simpson指數顯示3組物種多樣性有明顯差異，ECC組物種多樣性與Normal組相似，但高于CBDS組；CBDS組高于Normal組(表2)。多樣性反映的是組間菌群組成差異，本文采用主坐標分析(PCoA)來直觀顯示，如圖2所示，3組樣本區域盡管在X軸與Y軸上存在一定重合，但3組中心存在距離，因此3組間菌群構成存在差異。

圖2 組間PCoA分析

2.4 差異菌屬鑒定 3組差異菌屬鑒定如圖3所示：Citrobacter在Normal組中的含量顯著高于ECC組和CBDS組(P<0.001)。Paraprevotella和Flavonifractor在Normal組中的含量顯著高于ECC組和CBDS組(P值均<0.01)。此外，在Normal組中Bilophila、Bacteroides、Fusicatenibacter、Megamonas、Alistipes和Anaerofilum的含量

表1 3組一般資料比較

表2 3組間菌群多樣性的比較

增加，與ECC組和CBDS組相比，差異均有統計學意義(P值均<0.05)。Allobaculum在CBDS組中的含量與ECC組相比,差異有統計學意義(P<0.01)。CBDS組和ECC組Sutterella的含量與Normal組相比，差異均有統計學意義(P值均<0.05)。

2.5 3組菌群組成差異性分析 線性判別分析(LEfSe)顯示，在門水平上，ECC組和Normal組中無代表性的菌門，而Verrucomicrobia在CBDS組明顯富集。在科水平上，Lactobacillaceae和Prevotellaceae在ECC組中明顯增多，Enterococcaceae和Verrucomicrobiaceae在CBDS組中明顯增多，而在Normal組中Veillonellaceae和Campylobacteraceae明顯富集。在屬類水平上，ECC組中顯著差異的菌屬是Prevotella、Lactobacillus、Megasphaera、Sutterella、Alloprevotella.s__uncultured_Bacteroidetes_bacterium和Prevotella.s__uncultured_Bacteroidetes_bacterium，Normal組中顯著差異的菌屬是Flavonifractor、Fusicatenibacter、Allisonella、Allisonella.s__uncultured_bacterium、Campylobacter和Romboutsia。除此之外，Enterococcus、Akkermansia、Allobaculum.s__uncultured_bacterium和Allobaculum是CBDS組中顯著差異的菌屬(圖4)。

注：*，與Normal組比較，P<0.05；#，與CBDS組比較，P<0.05。

2.6 菌群與臨床指標的相關性分析Prevotella與抗生素、抑酸藥和保肝藥的使用呈負相關。Lactobacillus、Megasphaera、Sutterella與TBil和DBil呈正相關，此外，Lactobacillus還與AST、ALT、ALP、GGT和年齡呈正相關，Megasphaera和ALP呈正相關，Sutterella與AST呈正相關(附件1)。

注:a，不同的顏色表示不同分組,除黃色節點表示的是在組間絕對定量并無顯著差異的物種外,樹枝中其他3種顏色節點表示在對應組別中絕對定量顯著高的物種, 節點直徑大小與豐度大小呈正比;b，不同顏色的條形表示不同組別中LDA score(log10)大于2且在該組中豐度顯著高的差異物種,條形圖的長短代表的是LDA score值大小。

3 討論

膽管癌是一種侵襲性高且預后差的腫瘤，根治性手術切除是首選治療方法，但多數患者就診時已是晚期，能根治性切除的僅占35%[1]。ECC是膽管癌最常見的類型，占比約75%[9]，5年生存率在20%～30%[10]。最近研究[11]表明膽管癌患者腸道菌群明顯發生紊亂，但對ECC患者腸道菌群變化還未見相關研究。

本研究結果表明無論是多樣性分析或菌群差異分析，均提示ECC菌群構成發生了明顯改變。首先，ECC組的多樣性與Normal組相似，卻高于CBDS組，Chen等[12]同樣發現遠端膽管癌患者腸道菌群多樣性明顯高于膽總管結石患者。其次在多樣性的分析中，ECC組的菌群結構與CBDS組和Noaml組明顯不同，這與Lee等[11]和Avilés-Jiménez等[13]研究的結果一致。此外，與ECC組和Normal組相比，CBDS組物種多樣性明顯減少，有研究[14]報道稱與健康人群相比，膽總管結石患者腸道菌群多樣性明顯減低，且腸道菌群紊亂與膽總管結石形成密切相關，其機制可能是通過影響膽汁酸和膽固醇代謝導致。

Proteobacteria大多為條件性致病菌，是脂多糖主要生成來源，與炎癥反應密切相關，且大鼠中脂多糖暴露會導致快速的肝損傷[15]。本研究結果顯示，ECC組中Sutterella(Proteobacteria的成員)明顯富集且Sutterella的占比與TBil、DBil呈正相關。說明炎癥反應在ECC的疾病演化中仍扮演重要角色，但炎癥反應程度可能較CBDS輕緩，持續時間長。Sutterella對人膽汁酸具有較強抵抗力，這可能是其在膽道和腸道中存活的原因[15]。此外，Sutterella在十二指腸中含量最高，從十二指腸至結腸梯度遞減，具有輕度的促炎能力[16-17]。

Bacteroidetes大約有7000個不同物種，是最大的革蘭陰性菌門類[18]。Prevotella是其主要菌屬[19]，筆者發現Prevotella在ECC組明顯富集。Prevotella是輔助性T淋巴細胞(Th)17的強誘導劑，腸道Th17遷移可促進腫瘤發生發展[20-21]，推測Prevotella誘導Th17的活化是ECC發生發展的一個重要環節。Vich等[22]的研究表明除抗生素外，抑酸藥也會影響腸道菌群的多樣性和物種結構。有研究[23]指出抑酸藥可以通過提高胃腸道pH值抑制Prevotella，另外在一項研究[24]中發現抗生素治療后患者腸道菌群的Bacteroidetes明顯減少，同樣本研究結果也顯示抑酸藥、抗生素與Bacteroidetes中的Prevotella呈負相關。本研究還發現Lactobacillus和Megasphaera在ECC組中明顯增加，且與TBil、DBil等肝功能指標呈正相關，說明兩者也與ECC疾病進展密切相關。Lactobacillus可以將初級膽汁酸轉化為次級膽汁酸[25]，報道[26-27]顯示次級膽汁酸增多是膽管癌變的重要因素。ECC組Lactobacillus增加會代謝生成更多的次級膽汁酸，促進ECC的發生發展。Megasphaera是瘤胃微生物組的重要成員，正常情況下可生成短鏈脂肪酸，對腸道屏障功能具有保護作用[28]。Megasphaera擴增也可誘發炎癥反應，從癌前病變至實性癌灶中均檢測到Megasphaera。已經有研究者[29]提出Megasphaera在促進子宮宮頸發育異常和宮頸上皮內瘤變中起著重要作用，另有研究[30]發現與口腔癌患者相比，Megasphaera在口腔黏膜白斑患者中豐度也明顯增加。Cortez等[31]發現在PSC中Megasphaera豐度增加，且Megasphaera與TBil、GGT呈正相關。而PSC是ECC常見的高危因素，本研究描述了Megasphaera在ECC組明顯增多，這可能為進一步研究Megasphaera與ECC發生發展之間的關系提供一定的線索。Wu等[32]進一步發現Megasphaera可通過影響氨基酸代謝參與癌癥疾病進展。

當然，本研究局限性在于樣本數量較少，未來也會擴大樣本量進一步研究探索腸道菌群變化與ECC的潛在聯系。

綜上所述，本研究表明，ECC患者腸道菌群發生明顯改變，表現為Prevotella、Lactobacillus、Megasphaera、Sutterella明顯增多，且ECC患者腸道菌群改變與肝功能和藥物的使用密切相關。該研究將為從腸道菌群角度預防或治療ECC提供研究基礎。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：李濤、王盼梁負責課題設計，資料分析，撰寫論文；袁梓博、馮泉凱參與收集數據，修改論文；李捷負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。

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