駝奶中乳酸菌的分離鑒定

任冬艷，李 磊，李翠平，孫潔宇，韓毅峰，閆繼彪

（內蒙古普澤生物制品有限責任公司，內蒙古呼和浩特 010080）

駱駝是我國西北和華北荒漠、半荒漠地區的重要畜種資源之一，也是這一地區草原畜牧業的重要組成部分。駝乳素有“沙漠白金”的美譽，作為一種營養價值較高的食物，駝乳雖然已經得到了世界上多數國家的認可，但是在日常生活中，人們對于駝乳依然并不熟悉，其食用并不廣泛。經權威機構測定，駝乳中含有大量的維生素B、C 以及礦物元素，因此，駝乳以其豐富的營養被許多人們所青睞。由于駝乳越來越被人們所熟知，市場中駝乳的需求量增加，為游牧民族的人們帶來了新的收入增長點。

采用16S rRNA 基因序列方法對乳酸菌進行分類，已經成為當今使用最多的方法[1]。研究微生物的種類有利于發掘生物多樣性、微生物類群多樣性、生態類型多樣性、遺傳多樣性[2]。本研究對采自內蒙古阿拉善地區的駝奶樣品中的乳酸菌進行分離鑒定，對菌種資源的挖掘和保護具有一定意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 駝奶樣品來源

新鮮駝奶樣品采自內蒙古阿拉善牧民家庭。將樣品置于無菌容器內，低溫帶回實驗室，4 ℃冰箱保存。

1.1.2 培養基與試劑

培養基：MRS 固體培養基、MRS 液體培養基、M17 固體培養基、M17 液體培養基，由深市環凱微生物科技有限公司生產。

試劑：PBS 緩沖液、脫脂乳保護劑、細菌DNA提取試劑盒PCR 擴增和電泳所用試劑。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品收集

收集樣品采用直接取樣法。采集樣品并對樣品進行編號標注，于4 ℃便攜式冰箱內運回實驗室待研究。

1.2.2 樣品分離

結合乳酸菌的特性選擇較為合理的分離方法，根據相關理論可知，涂布法是較為合適的方法[3]。取駝乳加生理鹽水進行梯度稀釋，然后吸取0.2 mL 合適的稀釋液分別涂在兩種固體培養基上，然后將涂有固體培養基的平板放置在培養箱內厭氧培養48 h。菌落形成后，隨機挑取出形態特征不同的革蘭氏染色陽性單個菌落于相應的液體培養基中，37 ℃厭氧培養24 h。在相應的固體培養基上劃線分離，37 ℃厭氧培養48 h，如此反復純化3～4 次，轉移至相應液體培養基中增殖，進行純化培養[4]。對純化好的菌液進行保藏。

1.2.3 基因組DNA 提取及16S rRNA 基因的PCR擴增

用TIANampBacteria DNA Kit 提取基因組DNA，用ND-2000C 微量紫外分光光度計測其濃度和OD260/280 值。

PCR 擴增體系：5 μL Easy Taq Buffer（Mg2+）；4 μL High Pure d NTPs（2.5 mmol/L）；1.5 μL 引物FA-27F（濃度為10 mmol/L）；1.5 μL 引 物RA-1495R（濃 度10 mmol/L）；0.5 μL Easy Taq DNA polymerase（5 U/μL）；2 μL DNA 模 板（質量濃度100 ng/μL）；35.5 μL H2O。PCR 擴增采用細菌16S rRNA 基因通用引物[5]。

PCR 擴增循環參數：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30個循環；72 ℃末端延伸10 min。

1.2.4 16S rRNA 序列測定和同源性分析

將PCR 產物送到派森諾生物技術有限公司進行雙向測序，運用DNAStar 6.1 軟件包中的SeqMan 軟件將其進行拼接，最終獲得1 400 bp 的有效序列。利用Blast 軟件將測定的序列與GenBank/EMBL/DDBJ數據庫中已知分類地位的乳酸菌基因序列進行同源性比較，應用軟件Mega 7.0 構建系統發育樹[6]。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌分離株的菌落形態

根據菌落的形態特征、革蘭氏染色結果和過氧化氫酶試驗，將從駝奶中分離到的7 株菌株初步定為乳酸菌。在固體培養基上菌落形狀呈圓形，中心凸起，邊緣整齊，表面光滑或者粗糙，顏色為白色或乳白色。

2.2 乳酸菌基因提取結果和16S rDNA 的擴增結果

由圖1 可知，用微量紫外分光光度計測定提取得到乳酸菌菌株基因組DNA，所有分離株DNA 的純度值（A260/A280）都 在1.8～2.0，濃度范圍在100～3 000 ng/μL，分離株基因組DNA 是滿足后續試驗要求的。由于不存在非特異性擴增，因此可以判斷菌株16S rDNA 符合條件，可以進行后續的操作，即送到指定單位進行純化以及測序。

圖1 16S rRNA 基因的PCR 擴增產物電泳結果

2.3 同源性分析

由圖2 所示，菌株T2、T9 和T12 與模式株Lactococcus lactisATCC 19435 聚在一起，同源性為99%，可歸為Lactococcus lactis。T4 和T10 與模式株Enterococcus gilvus ATCC BAA-350 聚類，同源性為97%，可歸為Enterococcus gilvus。T5 和模式株Lactobacillus paracaseiATCC 25302（D79212）聚類，同源性為99%，可歸為Lactobacillus paracasei。T8 和模式株Leuconostoc mesenteroidesNCFB529聚 類，同源性為98%，故鑒定為Leuconostoc mesenteroides。

圖2 駝奶分離株的16S rRNA 基因序列的系統發育樹

3 結論

本研究從駝奶中分離出的乳酸菌一共有7 株，經過一系列的分析以及測定可以判斷這7 株乳酸菌為3 個 屬4 個 種，包 括2 株Enterococcus gilvus，1 株Lactobacillus paracasei，1 株Leuconostoc mesenteroides，3 株Lactococcus lactis，該樣品多樣性較為豐富，Lactococcus lactis為優勢菌種。