一種檢測KPC和NDM耐藥基因的雙重PCR-LF方法建立及初步應用*

王 潔,裴 兵,孫 寧,王衛萍，王 穎，李曉軍△

1.南京醫科大學附屬宿遷第一人民醫院中心實驗室，江蘇宿遷 223800；2.東部戰區總醫院臨床中心實驗科，江蘇南京 210002

隨著碳青霉烯類抗菌藥物的廣泛應用,耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌(CRE)逐年增多[1]，給感染的治療帶來了極大的挑戰[2]。在CRE的耐藥機制中，最主要是產碳青霉烯酶，其中肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(KPC)和新德里金屬β-內酰胺酶(NDM)是目前研究最多也最為常見的碳青霉烯酶。目前，采用常規實驗室的藥敏試驗方法指導臨床用藥，存在著培養時間過長的缺點，嚴重影響了臨床治療時效性。為了適應臨床治療對快速檢測的需求，低成本、快速的側流層析(LF)技術得到進一步發展[3]。本研究將雙重聚合酶鏈反應(PCR)技術和LF技術有機結合，建立雙重PCR-LF方法檢測2種重要碳青霉烯酶基因(KPC和NDM)，實現在一個反應體系中快速、特異地檢測2個靶標基因，并將該方法直接用于臨床無菌體液標本的檢測，為早期指導臨床用藥提供依據。

1 材料與方法

1.1菌株來源 攜帶KPC、NDM肺炎克雷伯菌，產KPC-2的碳青霉烯類抗菌藥物耐藥標準肺炎克雷伯菌菌株ATCCBAA-1705，攜帶blaIMP的銅綠假單胞菌，攜帶blaVIM的惡臭假單胞菌，攜帶blaNDM-1的肺炎克雷伯菌均由東部戰區總醫院中心實驗科微生物室保存。

1.2儀器與試劑 Premix TaqTM(TaKaRa TaqTMVersion 2.0 plus dye)； PCR分析試劑盒(Takara公司)和DL2000 DNA標記物(Takara公司)；TIANamp Blood DNA 檢測試劑盒(天根生物科技有限公司)；核酸染料GelRed(美國Biotium公司)。PCR擴增儀(美國BioRad公司)、電泳儀(美國BioRad公司)；凝膠電泳成像分析系統(上海歐翔科學儀器有限公司)；高速離心機(Eppendorf5417R)；VITEK 2 Compact 全自動細菌鑒定及藥敏分析系統(法國生物梅里埃公司)；微量分光光度計(美國Thermo Fisher Scientific公司)。

1.3方法

1.3.1DNA提取 將細菌接種于MH瓊脂平板上，分區劃線培養，挑取單個菌落，將其懸浮于100 μL滅菌去離子水，100 ℃ 10 min，12 000×g離心5 min，轉移上清液至—20 ℃保存備用。無菌體液標本DNA按照試劑盒說明書進行提取。

1.3.2引物 根據GenBank已發表的序列[4-6]，設計KPC、NDM引物。引物序列由上海Invotrigen公司合成。

1.3.3雙重PCR 擴增體系(25.0 μL)：Premix Ex Tap Hot Start Version 12.5 μL，2種耐藥基因(KPC、NDM)的正向和反向引物(10 μmol/L)各加0.5 μL至同一反應體系，1.0 μL DNA模板，加ddH2O補足至25.0 μL。反應條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 40 s,55～60 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，共計35個循環；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，10個循環；72 ℃ 10 min。取產物經瓊脂糖凝膠電泳后，進行測序驗證。

1.3.4雙重PCR方法學評價 將攜帶KPC、NDM的肺炎克雷伯菌，按照上述1.3.1步驟進行DNA提取后，檢測其水平，進行10倍梯度稀釋，按照建立的雙重PCR反應體系進行檢測。

1.3.5LF試紙的制備與性能測試 以半抗原地高辛、熒光素與相應抗體的免疫反應為基礎，制備LF試紙。在雙重PCR檢測KPC和NDM的研究基礎上，將上述KPC和NDM引物進行標記(KPC上下游引物分別標記生物素和地高辛；NDM上下游引物分別標記生物素和熒光素)，擴增帶有雙標記的DNA產物，電泳后回收產物，利用NanoDrop-1000檢測其水平；而后進行LF試紙的性能測試，以1 ng的雙標記DNA產物為測試模板，首先分析不同抗體水平的檢測效果，兩條檢測線：T1為抗地高辛抗體，T2為抗熒光素抗體，質控線C為生物素化的牛血清清蛋白(B-BSA)。

1.3.6雙重PCR-LF檢測KPC和NDM 采用雙重PCR-LF檢測標準菌株和臨床分離菌株中的KPC和NDM基因。取雙重/單重PCR產物5 μL點樣在層析試紙條上，5～10 min后進行結果判讀。

1.3.7應用雙重PCR-LF檢測臨床標本 收集臨床微生物送檢無菌體液標本120份(包括腦脊液、穿刺液、關節液、引流液等)，進行DNA提取。按照上述建立起來的反應體系，進行雙重PCR-LF檢測。

1.4統計學處理 采用SPSS19.0統計軟件進行數據處理及統計分析。將雙重PCR-LF的檢測結果與耐藥表型結果進行配對比較，采用McNemar檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1雙重PCR檢測KPC和NDM方法學評價 雙重PCR檢測KPC和NDM的檢測限為200 CFU/mL，與常規單重PCR檢測結果一致，見圖1。

注：A為雙重PCR結果；B為常規PCR擴增KPC；C為常規PCR擴增NDM；M為DL1000 DNA 標記物；7～1為梯度稀釋的產KPC和NDM的肺炎克雷伯菌(2～2×106 CFU/mL) 。

2.2LF試紙的性能測試 LF試紙的性能測試結果表明，抗地高辛抗體、抗熒光素抗體和B-BSA的點樣水平分別為250、50、50 ng時效果最佳，見圖2。

圖2 不同抗體水平對檢測雙標記DNA的影響

2.3雙重PCR-LF檢測KPC和NDM方法學評價 雙重PCR-LF檢測KPC和NDM，最低可檢測到200 CFU/mL的肺炎克雷伯菌，并且與其他超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)基因沒有交叉反應，見圖3。

注：7～1為梯度稀釋的產KPC和NDM的肺炎克雷伯菌(2～2×106 CFU/mL)；A為雙重PCR-LF檢測結果；B為單重PCR-LF檢測KPC的結果；C為單重PCR-LF檢測DNM的結果。

2.4雙重PCR-LF與藥敏表型檢測結果比較 以藥敏表型為參考方法，雙重PCR-LF檢測的靈敏度為69.39%，特異度為92.96%，Kappa值為0.644，兩種方法結果比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 雙重PCR-LF與藥敏表型檢測結果比較(n)

3 討 論

據2017年全國細菌耐藥監測報告顯示，在臨床常見細菌感染中，大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類抗菌藥物(對亞胺培南、美羅培南或厄他培南任意一種藥物耐藥)的耐藥率分別為1.5%、9.0%、20.7%和56.1%。就江蘇省而言，碳青霉烯類抗菌藥物耐藥率高于全國平均水平，這一現象對當地居民的健康和感染控制造成了嚴重威脅[7-10]。因此，迫切需要建立一種快速、準確的碳青霉烯酶基因檢測方法，指導臨床用藥，縮短TAT時間，避免抗菌藥物的濫用，預防產碳青霉烯酶細菌暴發性感染。

常規微生物實驗室多采用藥敏表型檢測的方法指導抗菌藥物使用，需要進行細菌分離培養，整個檢測流程時間較長，且易產生假陰性[11]，易延誤治療。多重PCR可一次擴增多種耐藥基因，提高檢測效率同時降低檢測成本，減輕患者負擔[5]。然而多重PCR仍存在一定不足，例如：常規的多重PCR技術需采用電泳或測序進行產物分析，實時熒光PCR技術需要配有熒光檢測通道的PCR儀器，存在著操作煩瑣、易污染等問題，且需要嚴格的操作流程和實驗環境要求。

本研究將雙重PCR檢測方法和LF技術相結合。LF技術主要分為兩類，一類是以堿基互補配對原則為反應基礎的核酸LF技術(NALFT)；另一類是以免疫反應為基礎的LF技術(NALFIA)，即在雙鏈DNA上標記半抗原或生物素，而后利用生物素-親和素反應或半抗原-抗體的免疫反應，以膠體金或量子點等作為標記物，進行核酸檢測，實現快速、準確、可視化的檢測需求。

本研究建立的雙重PCR-LF方法直接用于無菌體液標本的檢測，結果顯示，LF試紙能夠快速有效檢測到耐藥基因KPC和NDM，與藥敏表型檢測結果的Kappa值為0.644，一致性較好，且靈敏度達69.39%，特異度達92.96%，可為臨床用藥提供依據。但是本研究發現，部分無菌體液標本的藥敏表型為耐藥表型，但雙重PCR-LF方法檢測結果為陰性。分析原因：一是細菌的耐藥方式并不僅局限于產碳青霉烯酶[12]；二是本研究建立的方法不能包含全部的碳青霉烯酶基因。但是隨著細菌耐藥機制研究的不斷深入，發現KPC和NDM是較為常見和分布較廣的碳青霉烯酶[2,13-14]。因此，從一定程度上講，多重PCR-LF可以滿足臨床檢測碳青霉烯酶基因的需求。

綜上所述，本研究建立的雙重PCR-LF方法檢測時間約為3 h，且靈敏度、特異度均達到較高水平，實現了碳青霉烯酶基因的快速檢測，可在臨床藥敏結果出來之前，指導臨床用藥，避免抗菌藥物的濫用。同時，該檢測方法也為今后在一個反應體系納入3種及以上的耐藥基因檢測方法提供了思路與基礎。