維生素B12聯(lián)合鼠神經(jīng)生長因子對(duì)腦癱幼鼠智力的改善作用及機(jī)制研究

韓欣，丁曉玲，包蕊，王馨，余濤

腦癱是一類中樞神經(jīng)障礙綜合征，病人主要有運(yùn)動(dòng)障礙和智力低下表現(xiàn)。流行病學(xué)資料顯示［1］，我國腦癱病兒發(fā)病率較高，約為5.5%～7.8%，位居世界前列。腦癱可給家庭和社會(huì)造成沉重的負(fù)擔(dān)，對(duì)病人也有長遠(yuǎn)、嚴(yán)重的影響［2］。鼠神經(jīng)生長因子（MNGF）屬于一種腦神經(jīng)營養(yǎng)藥物，在腦癱病兒中常用，且有一定效果［3］；維生素B12（VB12）則可促進(jìn)腦神經(jīng)發(fā)育，促使嬰幼兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常發(fā)展，且既往有研究證實(shí)缺乏VB12是神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生的危險(xiǎn)因素［4-5］?；诖?，2018年1—4月進(jìn)行本研究，嘗試將兩者聯(lián)用于腦癱幼鼠中，期待能增強(qiáng)療效。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動(dòng)物72只Wistar大鼠，體質(zhì)量范圍10～20 g，體質(zhì)量（15.23±2.12）g，2周齡，雌性36只、雄性36只，清潔級(jí)，購自上海凱學(xué)生物科技公司，許可證號(hào)為SCXK（滬）2020-0211。飼養(yǎng)環(huán)境與條件：25～27℃、30%～55%相對(duì)濕度、光照和黑暗各12 h交替、分籠飼養(yǎng)、標(biāo)準(zhǔn)飼料、自由進(jìn)食飲水。本研究符合一般動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)原則。

1.1.2主要試劑及儀器VB12注射液購自新鄉(xiāng)市常樂制藥有限責(zé)任公司；MNGF注射液購自未名生物醫(yī)藥有限公司；原位末端凋亡法（TUNEL）試劑盒購自美國Roche公司；兔抗鼠天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白前酶-3（Pro-Caspase3）、腦組織天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase3）單克隆抗體（一抗，放大倍數(shù)為1∶1 000）、山羊抗兔Pro-Caspase3、Caspase3多克隆抗體（二抗，放大倍數(shù)為1∶10 000）均購自美國Santa Cruz公司。

XR-XY1032型Y迷宮購自上海欣軟信息科技有限公司；XBS-03S型密閉缺氧箱購自杭州艾普儀器設(shè)備有限公司；CX41-12C02型光學(xué)顯微鏡購自日本Olympus公司；JYH27020型電泳儀購自北京中慧天誠科技有限公司；MICROPLUSER型電轉(zhuǎn)儀購自美國Bio-rad公司；JS-680D型凝膠成像分析系統(tǒng)購自上海迪圖生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1造模系統(tǒng)隨機(jī)抽樣法取48只建模，余24只按系統(tǒng)隨機(jī)抽樣分為假手術(shù)組和對(duì)照組。具體：取建模幼鼠，乙醚吸入麻醉并固定。消毒頸部皮膚，切開左側(cè)皮膚暴露頸動(dòng)脈并用0號(hào)絲線結(jié)扎，縫合皮膚切口，預(yù)防感染，并將其置于恒溫水浴容器中37℃、2 h。然后置于密閉缺氧箱，通入氧氣與氮?dú)饣旌蠚怏w，兩者體積分?jǐn)?shù)分別為8%、92%，速度1 L∕min，時(shí)間2 h。將Longa評(píng)分為2～3分者記為造模成功［6］。假手術(shù)組僅做切口左側(cè)頸動(dòng)脈暴露后縫合，對(duì)照組不給予任何干預(yù)。將建模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、VB12組、MNGF組、VB12+MNGF組。

1.2.2配藥和給藥VB12注射液和MNGF注射液均采用無菌生理鹽水配置，終濃度分別為70 mg∕100 mL、2 mg∕100 mL。VB12組神經(jīng)外膜下注射VB12注射液1 mL∕100 g體質(zhì)量，MNGF組同法予以MNGF注射液1 mL∕100 g體質(zhì)量，VB12+MNGF組同法先后給予VB12注射液1 mL∕100 g體質(zhì)量、MNGF注射液1 mL∕100 g體質(zhì)量，其余各組均同法予以等量無菌生理鹽水，每天1次，維持3周。

1.2.3一般情況觀察觀察各組飲食、大小便、睡眠、日?；顒?dòng)、體質(zhì)量等。

1.2.4智力檢測(cè)給藥完成后次日檢測(cè)，上下午各采用Y迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)定10次，參數(shù)：電壓50～60 V，延時(shí)5 s。首先適應(yīng)訓(xùn)練3～5 min，隨意變換安全區(qū)域。電擊大鼠，使其逃到安全區(qū)域，打開燈光并持續(xù)10～15 s。將此時(shí)所在支臂定為正式檢測(cè)的起始位置，記錄正確次數(shù)、開燈至逃至安全區(qū)所用時(shí)間。

1.2.5神經(jīng)元凋亡指數(shù)（AI）檢測(cè)完成智力檢測(cè)后處死大鼠，迅速剝?nèi)∧X皮質(zhì)以福爾馬林溶液固定后脫水、包埋、切片（層厚4 μm）。脫蠟后水化，流動(dòng)水漂洗。0.1%TritonX100溶液浸泡8 min，流水沖洗后換用PBS緩沖液沖洗。滴加標(biāo)記混合物50 μL，陰性對(duì)照僅滴加稀釋液，37℃、60 min。PBS緩沖液沖洗，封片，采用圖像分析系統(tǒng)計(jì)算神經(jīng)元AI。

1.2.6蛋白表達(dá)檢測(cè)同上操作獲取腦皮質(zhì)中央前回區(qū)組織，采用蛋白免疫印跡法（WB）檢測(cè)：組織勻漿、裂解后提取總蛋白，上樣每孔20 μg，凝膠電泳。轉(zhuǎn)膜120 min，脫脂奶粉封閉2 h。滴加一抗，4℃搖床孵育，次日滴加二抗，常溫孵育。2 h后曝光、顯影和定影，凝膠成像軟件分析Pro-Capase3、Capase3蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 觀察指標(biāo)觀察各組大鼠一般情況、Y迷宮實(shí)驗(yàn)正確次數(shù)和平均開燈至逃至安全區(qū)所用時(shí)間，神經(jīng)元AI，腦組織Pro-Capase3、Capase3蛋白表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用SPSS 25.0版檢驗(yàn)。計(jì)量資料±s采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組一般情況變化造模期間共有10只大鼠死亡，余38只大鼠根據(jù)系統(tǒng)隨機(jī)抽樣法分為四組，剔除給藥期間意外死亡大鼠，模型組余7只、VB12組余9只、MNGF組余8只、VB12+MNGF組余8只，另對(duì)照組與假手術(shù)組各12只大鼠。對(duì)照組大鼠正常飲食、排便，且日?；顒?dòng)正常，精神狀態(tài)佳，體質(zhì)量逐漸增長，假手術(shù)組手術(shù)后精神萎靡、食欲不佳，后逐漸好轉(zhuǎn)并恢復(fù)正常。其余四組建模后大鼠均精神萎靡、睡眠較差、活動(dòng)減少、食欲不佳、體質(zhì)量下降，VB12組、MNGF組、VB12+MNGF組干預(yù)后狀態(tài)均有所好轉(zhuǎn)，而模型組狀態(tài)均無好轉(zhuǎn)，且有部分大鼠出現(xiàn)拒食、步態(tài)不穩(wěn)、抽搐等表現(xiàn)。

2.2 Y迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果各組幼鼠Y迷宮實(shí)驗(yàn)正確次數(shù)、平均開燈至逃至安全區(qū)所用時(shí)間比較均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與對(duì)照組和假手術(shù)組比較，模型組正確次數(shù)減少，平均開燈至逃至安全區(qū)所用時(shí)間延長（均P＜0.05）；與模型組比較，VB12組、MNGF組、VB12+MNGF組正確次數(shù)均增多，平均開燈至逃至安全區(qū)所用時(shí)間均縮短（均P＜0.05）。見表1。

表1 各組幼鼠Y迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較∕±s

表1 各組幼鼠Y迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較∕±s

注：MNGF為鼠神經(jīng)生長因子，VB12為維生素B12。①與對(duì)照組比較，P＜0.01。②與假手術(shù)組比較，P＜0.01。③與模型組比較，P＜0.01。

?

2.3 神經(jīng)元AI與腦組織Pro-Capase3、Capase3蛋白表達(dá)比較各組神經(jīng)元AI比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與對(duì)照組和假手術(shù)組比較，模型組神經(jīng)元AI升高（P＜0.05）；與模型組比較，VB12組、MNGF組、VB12+MNGF組神經(jīng)元AI均下降（P＜0.05）。各組腦組織Pro-Caspase3蛋白表達(dá)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖1。各組腦組織Caspase3蛋白表達(dá)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與對(duì)照組和假手術(shù)組比較，模型組腦組織Caspase3蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；與模型組比較，VB12組、MNGF組、VB12+MNGF組腦組織Caspase3蛋白表達(dá)均下降（P＜0.05），見圖2，表2。

圖1 各組幼鼠腦組織Pro-Caspase3蛋白表達(dá)檢測(cè)

圖2 各組幼鼠腦組織Caspase3蛋白表達(dá)檢測(cè)

表2 各組幼鼠神經(jīng)元AI與腦組織Pro-Capase3、Capase3蛋白表達(dá)比較∕±s

表2 各組幼鼠神經(jīng)元AI與腦組織Pro-Capase3、Capase3蛋白表達(dá)比較∕±s

注：①與對(duì)照組比較，P＜0.01。②與假手術(shù)組比較，P＜0.01。③與模型組比較，P＜0.01。

?

3 討論

3.1 本研究的意義VB12對(duì)促進(jìn)嬰幼兒智力發(fā)展有積極作用，且有報(bào)道表明腦癱病兒的血清VB12水平下降［7］。也有研究選取痙攣性腦癱病兒采用VB12和MNGF聯(lián)合治療發(fā)現(xiàn)其效果優(yōu)于單純MNGF治療者，證實(shí)VB12可輔助治療痙攣性腦癱［8］。MNGF則是維持神經(jīng)元代謝、促進(jìn)受損的神經(jīng)元恢復(fù)的必需活性因子，還可促使神經(jīng)元分化，增強(qiáng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能，且有報(bào)道顯示MNGF可提高腦癱病兒的智力，增強(qiáng)其日常生活能力，對(duì)促進(jìn)其運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)也有積極作用［9］。結(jié)合上述報(bào)道和分析，推測(cè)VB12聯(lián)合MNGF可增強(qiáng)腦癱療效，這也是本研究的基礎(chǔ)。

3.2 本研究各組一般狀況比較分析本研究顯示，干預(yù)后對(duì)照組大鼠一般情況正常，假手術(shù)組也逐漸恢復(fù)正常，其余四組均精神萎靡、食欲不振，且模型組狀態(tài)均無好轉(zhuǎn)，甚至部分大鼠出現(xiàn)拒食、步態(tài)不穩(wěn)、抽搐等表現(xiàn)，VB12組、MNGF組、VB12+MNGF組狀況在干預(yù)后均改善，VB12+MNGF組與假手術(shù)組最為接近，提示VB12、MNGF注射均可減輕腦癱對(duì)幼鼠的影響，且兩者聯(lián)合作用更佳。腦癱可出現(xiàn)腦萎縮、腦室擴(kuò)大、腦組織軟化等病理改變，且腦皮質(zhì)神經(jīng)元有不同程度的變性、壞死，腦白質(zhì)發(fā)育障礙，再加上海馬區(qū)損傷等均可損害智力［10-11］。既往報(bào)道證實(shí)，VB12缺乏可影響腦神經(jīng)再生及功能代償，而補(bǔ)充VB12可增強(qiáng)損傷的腦神經(jīng)元的自我修復(fù)能力，還可促進(jìn)神經(jīng)纖維髓鞘化，確保中樞神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)功能恢復(fù)正常［12-13］。此外MNGF可改善智力［14］，結(jié)合既往研究歸納其作用機(jī)制包括：①M(fèi)NGF能夠上調(diào)大鼠梗死區(qū)周圍和海馬區(qū)缺血腦組織中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）和神經(jīng)生長因子（NGF），增強(qiáng)受損的神經(jīng)元的自我修復(fù)能力；②MNGF可上調(diào)腦損傷新生大鼠海馬區(qū)腦缺血組織中血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）及神經(jīng)絲蛋白（NFP）的表達(dá)，改善神經(jīng)功能；③MNGF能夠促進(jìn)腦損傷大鼠突起生長［15-17］。故而VB12聯(lián)合MNGF對(duì)腦癱幼鼠有顯著療效。

3.3 本研究Y迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較分析本研究還顯示，在正確次數(shù)上，四組建模后大鼠均少于對(duì)照組和假手術(shù)組，且VB12+MNGF組＞MNGF組＞VB12組＞模型組，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；在平均開燈至逃至安全區(qū)所用時(shí)間上，四組建模后大鼠均長于對(duì)照組和假手術(shù)組，且VB12+MNGF組＜MNGF組＜VB12組＜模型組，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），上述結(jié)果可知VB12和MNGF均可增強(qiáng)腦癱幼鼠的智力，且兩者聯(lián)合的作用更佳。

3.4 本研究各組大鼠神經(jīng)元AI、相關(guān)基因與蛋白表達(dá)比較分析本研究中還發(fā)現(xiàn)，各組大鼠神經(jīng)元AI差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），四組建模后大鼠神經(jīng)元AI均高于對(duì)照組和假手術(shù)組，且VB12+MNGF組＜MNGF組＜VB12組＜模型組，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），可知腦癱幼鼠神經(jīng)元凋亡最嚴(yán)重，給予VB12、MNGF干預(yù)后能夠減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，而VB12聯(lián)合MNGF干預(yù)的效果更佳。

本研究各組腦組織Pro-Caspase3均相近，而Caspase3蛋白差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），四組建模后大鼠大腦腦皮質(zhì)中央前回區(qū)組織Capase3蛋白表達(dá)均高于對(duì)照組和假手術(shù)組，且VB12+MNGF組＜MNGF組＜VB12組＜模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），可知VB12、MNGF均可抑制腦癱幼鼠腦組織Pro-Caspase3的水解程度，下調(diào)Caspase3蛋白表達(dá)，且VB12聯(lián)合MNGF的效果均最佳。

Pro-Caspase3是Caspase3蛋白的水解前物質(zhì)，能夠通過蛋白酶解活化，而活化的Caspase3能夠?qū)⒓?xì)胞內(nèi)底物迅速清除，執(zhí)行凋亡程序［18］。Caspase3是Caspase依賴途徑中的關(guān)鍵物質(zhì)，屬于腦損傷后接到神經(jīng)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵，細(xì)胞凋亡參與腦性癱瘓的發(fā)生和發(fā)展，且與神經(jīng)元凋亡脫氧核糖核苷酸（DNA）的裂解呈同步性。在腦癱大鼠腦皮質(zhì)中央前回區(qū)組織中，Pro-Caspase3的水解程度較高，因而Caspase3蛋白的表達(dá)較高且生物學(xué)活性較強(qiáng)，神經(jīng)細(xì)胞凋亡率隨之升高［19］。有研究顯示，對(duì)腦癱幼鼠給予MNGF腹腔注射能夠降低Pro-Capase3的水解程度，下調(diào)Caspase3蛋白的表達(dá)水平，且還發(fā)現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡率下降［20］。但是關(guān)于VB12對(duì)Pro-Caspase3水解程度的影響目前尚無相關(guān)報(bào)道，仍需要進(jìn)一步觀察其影響并探討其作用機(jī)制。結(jié)合上述研究結(jié)果和分析，推測(cè)VB12聯(lián)合MNGF很可能能夠通過抑制腦癱幼鼠腦皮質(zhì)中央前回區(qū)組織Pro-Caspase3的水解，控制Caspase3蛋白表達(dá)水平，抑制神經(jīng)元凋亡DNA的裂解，促進(jìn)受損神經(jīng)元的修復(fù)，減輕腦損傷，并通過該途徑降低腦癱大鼠神經(jīng)元凋亡率，發(fā)揮改善腦癱幼鼠智力的作用，達(dá)到治療目的。

4 總結(jié)

綜上所述，VB12聯(lián)合MNGF對(duì)腦癱幼鼠有顯著療效，且可顯著減少神經(jīng)元凋亡，推測(cè)與抑制腦組織Pro-Caspase3水解、下調(diào)Caspase3蛋白表達(dá)有關(guān)，兩者聯(lián)合的作用顯著優(yōu)于單獨(dú)使用。本研究為腦癱病兒臨床治療中VB12、MNGF聯(lián)合使用奠定了基礎(chǔ)，且明確了其作用機(jī)制，為其推廣應(yīng)用提供了參考，對(duì)腦癱病兒的臨床治療有一定的指導(dǎo)意義。本研究仍存在不足：VB12、MNGF治療腦癱幼鼠的最佳濃度、兩者聯(lián)合的最佳配比尚不明確，后續(xù)應(yīng)完善分組，細(xì)化研究。