HIV-1感染者外周血T細(xì)胞miR-155水平與免疫激活和耗竭的關(guān)系研究

趙增艷 韋彩雯 張?jiān)?程林芳 靳昌忠

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院崇明分院1全科醫(yī)學(xué)科，2神經(jīng)內(nèi)科（上海202150）；3浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院傳染病診治國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（杭州310003）

HIV-1 感染者進(jìn)展到艾滋病階段的一個(gè)重要特征是存在廣泛的非特異T 細(xì)胞慢性免疫激活，并能夠被抗病毒治療在一定程度上抑制［1-2］。許多T細(xì)胞免疫激活分子的表達(dá)與HIV-1感染密切相關(guān)，如CD38 和HLA-DR 等T 細(xì)胞激活標(biāo)記［3-4］。由于HIV-1 難以清除并以低水平持續(xù)存在，長(zhǎng)期刺激T 細(xì)胞激活進(jìn)而導(dǎo)致其增殖和應(yīng)答能力的缺失，即免疫耗竭［5-7］。miRNA 是細(xì)胞內(nèi)一類沒(méi)有編碼能力的RNA，在免疫細(xì)胞發(fā)育和免疫功能調(diào)控中有重要作用［8-10］。miR-155 近年來(lái)被發(fā)現(xiàn)是T 細(xì)胞功能分化的重要調(diào)控因子，可以調(diào)控CD4+T 細(xì)胞分化為不同的功能亞群，參與CD8+T 細(xì)胞的激活過(guò)程［9-10］。此外，miR-155 與HIV-1 感染密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，HIV-1 感染者血漿中的miR-155水平與HIV-1 疾病進(jìn)展程度有關(guān)，長(zhǎng)期不進(jìn)展者顯著較低［11-13］。此外，miR-155 還可以通過(guò)其它機(jī)制來(lái)抑制HIV-1 的感染，例如降低HIV-1 感染所需的宿主蛋白的表達(dá)水平等［14-15］。目前對(duì)于miR-155 在HIV-1 感染者T 細(xì)胞免疫應(yīng)答中的作用尚未明確，已有研究多是體外研究，基于HIV-1 感染者隊(duì)列的體內(nèi)研究較少。鑒于T 細(xì)胞免疫狀態(tài)對(duì)HIV-1 感染的重要性以及miR-155 在T 細(xì)胞功能調(diào)控中的重要作用，本文重點(diǎn)研究HIV-1 感染者miR-155 與T 細(xì)胞免疫激活和耗竭的關(guān)系，為臨床免疫狀況評(píng)估提供重要的參考指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 一般資料147 例HIV-1 感染者來(lái)自門(mén)診確診患者，抗病毒治療1年以上，選取58 例體檢者納入健康對(duì)照組。排除合并其它感染、血液或免疫性疾病者，以及近期使用免疫抑制劑或其它對(duì)T 細(xì)胞功能有影響的藥物的患者。HIV-1 感染者根據(jù)《中國(guó)艾滋病診療指南（2018 版）》［16］按照免疫學(xué)療效分為治療有效組（71 例）和治療無(wú)效組（76 例）。所有參與者均知情同意，研究方案通過(guò)浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)審核。

1.2 miR-155檢測(cè)抽取患者5 mL抗凝血，分離外周血單個(gè)核細(xì)胞并用免疫磁珠（德國(guó)美天旎公司）分選CD4+和CD8+T細(xì)胞后，使用Qiagen RNeasy Micro Kit 試劑盒（德國(guó)凱杰公司）提取細(xì)胞總RNA。使用Takara 熒光定量PCR 試劑（大連寶生物公司）和人miR-155 特異性引物（廣州銳博公司）進(jìn)行一步法定量PCR 檢測(cè)T 細(xì)胞內(nèi)miR-155 水平，內(nèi)參為U6 RNA，根據(jù)CT 值計(jì)算miR-155 相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)使用美國(guó)BD 公司FACScanto Ⅱ流式細(xì)胞儀，抗人CD3-PE-Cy7、抗人CD38-FITC、抗人CD4-PE、抗人CD8-APC 和抗人PD-1-FITC 抗體購(gòu)自BD 公司，抗體組合方案如下：CD3+CD4+CD8+CD38+和CD3+CD4+CD8+PD-1。每管取50 μL全血與抗體室溫避光孵育15 min 后裂解紅細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)。

1.4 HIV-1 RNA 定量檢測(cè)HIV-1 病毒載量檢測(cè)使用羅氏cobas AmpliPrep/cobas TaqMan 病毒載量檢測(cè)系統(tǒng)（瑞士羅氏公司）進(jìn)行，檢測(cè)下限為20 copies/mL。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0 軟件，組間比較采用t或χ2檢驗(yàn)，三組間比較采用單因素方差分析，相關(guān)分析采用Pearson 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況比較治療有效組CD4+T 細(xì)胞為（584.87 ± 242.43）/μL，高于治療無(wú)效組（374.89 ±193.46）/μL（P＜0.01），CD8+T 細(xì)胞治療有效組（548.23 ± 331.45）/μL 低于治療無(wú)效組（865.38 ±213.56）/μL，（P＜0.01）。見(jiàn)表1。

表1 HIV-1 感染者及健康對(duì)照組臨床信息和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較Tab.1 Comparison of clinical information and laboratory indexes between HIV-1 infected subjects and healthy controls x±s

2.2 外周血miR-155 水平比較治療無(wú)效組CD4+和CD8+T 細(xì)胞miR-155 水平分別為（47.53±11.30）和（67.98 ± 22.73），顯著高于治療有效組［（23.87 ±6.54）vs.（34.69 ± 12.78）］和健康對(duì)照組［（12.76 ±5.35）vs.（17.87±9.65）］（均P＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.3 T 細(xì)胞免疫激活和耗竭水平比較治療無(wú)效組CD4+和CD8+T 細(xì)胞免疫激活水平（CD38+%）最高，分別為（43.88±14.92）%和（56.93±15.79）%，治療有效組分別為（27.42±8.65）%和（38.87±9.13）%，高于健康對(duì)照組（P＜0.01）。見(jiàn)表1。

治療無(wú)效組T 細(xì)胞免疫耗竭水平（PD-1+%）最高，分別為（37.82 ± 16.48）%和（44.68 ± 20.37）%，治療有效組T 細(xì)胞免疫耗竭水平亦高于健康對(duì)照組，除治療有效組CD4+PD-1+%與健康對(duì)照之間差異外，其余差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表1。

2.4 外周血T 細(xì)胞miR-155 水平與免疫激活和耗竭指標(biāo)的相關(guān)性分析HIV-1 感染者T 細(xì)胞miR-155 水平與免疫激活和耗竭正相關(guān)（P＜0.05），健康對(duì)照組T 細(xì)胞miR-155 與細(xì)胞激活呈正相關(guān)（P＜0.05），與免疫耗竭相關(guān)性不顯著（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 外周血T 細(xì)胞miR-155 水平與免疫激活和耗竭指標(biāo)的相關(guān)性分析Tab.2 Correlation analysis of miR-155 level and immune activation and exhaustion in T cells

3 討論

有效的抗病毒治療能夠?qū)Ω腥菊叩拿庖吖δ芎蜖顟B(tài)起到一定的恢復(fù)作用［17-18］。除了CD4+T 細(xì)胞數(shù)量和比例這一經(jīng)典指標(biāo)外，T 細(xì)胞免疫激活、耗竭等指標(biāo)及其調(diào)控因素對(duì)判斷HIV-1 感染者免疫狀態(tài)有重要的臨床價(jià)值［19-20］。本文通過(guò)對(duì)抗病毒治療有效和無(wú)效的HIV-1 感染者以及健康對(duì)照進(jìn)行橫斷面觀察研究發(fā)現(xiàn)，HIV-1 感染者T 細(xì)胞miR-155 表達(dá)、免疫激活和耗竭水平均顯著升高，以治療無(wú)效者更顯著，miR-155 與免疫激活和耗竭水平正相關(guān)。這表明HIV-1 感染能提高T 細(xì)胞miR-155 表達(dá)，并影響T 細(xì)胞激活和耗竭水平，有效的抗病毒治療可以部分逆轉(zhuǎn)這一改變。但研究未發(fā)現(xiàn)miR-155 與HIV-1 載量存在直接相關(guān)性。

miR-155 可以通過(guò)多種機(jī)制影響HIV-1 感染。有研究發(fā)現(xiàn)HIV-1 感染者效應(yīng)型調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞miR-155表達(dá)水平高于未感染者［11-12］。miR-155能降低樹(shù)突狀細(xì)胞表面協(xié)同受體的表達(dá)以抑制HIV-1的感染能力［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-155 可通過(guò)調(diào)節(jié)T 細(xì)胞免疫激活和耗竭水平來(lái)影響感染的進(jìn)展。持續(xù)的非特異性T 細(xì)胞免疫激活是HIV-1 感染造成T 細(xì)胞免疫功能缺陷的主要因素［21］。miR-155能夠調(diào)節(jié)CD8+T 細(xì)胞不同亞群的增殖和分化，維持記憶型和效應(yīng)記憶型CD8+T 細(xì)胞的比例［22］。本研究發(fā)現(xiàn)miR-155 對(duì)于維持HIV-1 感染者的CD4+T 細(xì)胞的免疫激活狀態(tài)也很重要。PD-1 是一種免疫抑制性受體，與T 細(xì)胞免疫耗竭相關(guān)［7］。本研究發(fā)現(xiàn)HIV-1 感染者T 細(xì)胞表面PD-1 表達(dá)升高，有效的抗病毒治療能夠部分降低PD-1 的表達(dá)水平，這與既往研究一致［21］。但本研究并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)T 細(xì)胞表面PD-1 表達(dá)水平與病毒載量和CD4+T 細(xì)胞數(shù)存在相關(guān)性，而是與miR-155 相關(guān)，提示miR-155可能參與了T 細(xì)胞的免疫耗竭調(diào)控。

本研究存在一定的局限性，僅對(duì)HIV-1 感染者的T 細(xì)胞免疫狀態(tài)和miR-155 水平等指標(biāo)進(jìn)行了橫斷面研究，僅揭示了miR-155 與T 細(xì)胞免疫激活和耗竭的相關(guān)性，未闡明三者間的因果關(guān)系和相互作用機(jī)制。許多問(wèn)題還有待于通過(guò)隊(duì)列隨訪和機(jī)制研究進(jìn)一步探索。如T 細(xì)胞的免疫耗竭由免疫激活導(dǎo)致還是由miR-155 直接調(diào)控的機(jī)制，HIV-1感染是如何改變miR-155 表達(dá)水平，以及抗病毒治療恢復(fù)miR-155 水平和T 細(xì)胞免疫功能的原理。

總之，本研究結(jié)果提示miR-155 參與了HIV-1感染者T 細(xì)胞免疫激活和耗竭的調(diào)控，抗病毒治療能夠一定程度上抑制miR-155 表達(dá)水平并部分恢復(fù)T 細(xì)胞免疫功能。檢測(cè)T 細(xì)胞miR-155 水平可為臨床評(píng)估HIV-1 感染者T 細(xì)胞功能提供重要的參考。