動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的DNA甲基化改變

伊珞，周宏宇，仇鑫，李子孝，3，4，王擁軍，3，4

動(dòng)脈粥樣硬化是缺血性卒中、冠心病的主要致病原因[1]。動(dòng)脈內(nèi)膜血流紊亂區(qū)域內(nèi)皮功能障礙和內(nèi)皮下脂蛋白滯留相互作用，繼發(fā)炎癥，導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞激活、單核細(xì)胞募集、細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)和脂質(zhì)積聚，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成[2]。斑塊破裂和侵蝕（不穩(wěn)定）引起血栓形成、血管閉塞，造成急性血管事件發(fā)作[3]。研究表明，DNA甲基化在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展中具有重要調(diào)節(jié)作用[4]，動(dòng)脈粥樣硬化患者斑塊及外周血細(xì)胞中可檢測(cè)出特定位點(diǎn)或全基因組DNA甲基化水平改變[5]。本文從動(dòng)脈粥樣硬化病理過(guò)程、外周血細(xì)胞刺激及響應(yīng)、臨床心腦血管事件中DNA甲基化模式展開(kāi)敘述，以探索有前景的診療靶點(diǎn)和標(biāo)志物。

1 DNA甲基化與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成及進(jìn)展

動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成與進(jìn)展的不同階段表現(xiàn)出細(xì)胞特異性DNA甲基化改變，內(nèi)皮功能障礙、平滑肌細(xì)胞可塑性及巨噬細(xì)胞極化是DNA甲基化修飾的關(guān)鍵干預(yù)靶點(diǎn)[6]。

1.1 血管內(nèi)皮功能障礙 內(nèi)皮源性一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）催化NO產(chǎn)生舒張血管的平滑肌細(xì)胞并抑制其增殖[7]，內(nèi)皮依賴性血管平滑肌舒張異常是血管內(nèi)皮功能障礙的主要臨床評(píng)估指標(biāo)[8]，另外，血管內(nèi)皮細(xì)胞還可通過(guò)抗血栓形成、抗白細(xì)胞黏附等方式維持血管穩(wěn)態(tài)[9]。

1.1.1 血流動(dòng)力學(xué)依賴性DNA甲基化調(diào)節(jié)內(nèi)皮基因表達(dá) 局部擾動(dòng)流及低而往復(fù)的切應(yīng)力可通過(guò)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，DNMT）調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞基因的表達(dá)[10]。有研究顯示，低切應(yīng)力可降低10/11易位甲基胞嘧啶雙加氧酶（ten-eleven translocation-2，TET2）表達(dá)抑制自噬，進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙[11]。

小鼠體內(nèi)切應(yīng)力響應(yīng)的順式作用元件Krüppel樣因子（Krüppel-like factor，KLF）是eNOS轉(zhuǎn)錄的必要成分，血流紊亂區(qū)域內(nèi)皮DNMT1表達(dá)增加，誘導(dǎo)一氧化氮合酶3（nitric oxide synthase 3，NOS3）基因啟動(dòng)子內(nèi)位點(diǎn)高甲基化，引起eNOS表達(dá)下降[12]。DNMT1表達(dá)沉默可抑制小鼠結(jié)扎頸動(dòng)脈的內(nèi)皮細(xì)胞中增殖標(biāo)志物（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）和血管細(xì)胞黏附分子1（vascular cell adhesion molecule 1，VCAM1）等炎癥因子表達(dá)[13]。小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞切應(yīng)力敏感性差異性甲基化位點(diǎn)中同源異型盒A5（homeobox protein A5，HoxA5）基因和KLF3受DNMT1調(diào)節(jié)[10]，但是有研究顯示上述差異性甲基化位點(diǎn)與人類(lèi)心血管疾病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)是否相關(guān)尚不明確[14]。

DNMT3A在擾動(dòng)流誘導(dǎo)下富集于內(nèi)皮細(xì)胞，引起KLF4啟動(dòng)子內(nèi)位點(diǎn)高甲基化導(dǎo)致KLF4轉(zhuǎn)錄抑制與表達(dá)降低，下游NOS3和血栓調(diào)節(jié)蛋白（thrombomodulin，THBD）基因表達(dá)受到抑制引起血管舒張和抗凝功能受損，單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）基因表達(dá)增加誘發(fā)內(nèi)皮炎癥[15]。

1.1.2 動(dòng)脈粥樣硬化危險(xiǎn)因素通過(guò)DNA甲基化修飾介導(dǎo)血管內(nèi)皮舒張功能障礙 冠心病患者血流介導(dǎo)血管舒張功能（f l o wmediated dilation，F(xiàn)MD）與p66shc啟動(dòng)子甲基化程度呈正相關(guān)，S-腺苷同型半胱氨酸（S-adenosylhomocysteine hydrolase，SAH）可通過(guò)DN M T1介導(dǎo)小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞p66shc啟動(dòng)子中位點(diǎn)低甲基化，上調(diào)p66shc表達(dá)并通過(guò)氧化應(yīng)激引發(fā)內(nèi)皮舒張功能障礙[16]。

氧化型低密度脂蛋白（oxidation low lipoprotein，ox-LDL）可上調(diào)DNMT3B表達(dá)，誘導(dǎo)E1A激活基因阻遏子（cellular repressor of E1A-stimulated genes，CREG）基因啟動(dòng)子內(nèi)多個(gè)位點(diǎn)高甲基化，降低CREG表達(dá)，導(dǎo)致磷酸化eNOS水平降低，引起內(nèi)皮舒張功能障礙[17]。

研究結(jié)果表明，血液中Hcy、脂質(zhì)相關(guān)代謝產(chǎn)物等動(dòng)脈粥樣硬化危險(xiǎn)因素可通過(guò)DNA甲基化修飾介導(dǎo)內(nèi)皮功能舒張障礙從而誘發(fā)并加重動(dòng)脈粥樣硬化，應(yīng)用去甲基化藥物和代謝抑制治療則可有效改善內(nèi)皮舒張功能，輔助動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的臨床治療。

1.2 平滑肌細(xì)胞激活、增殖與表型轉(zhuǎn)換 平滑肌細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成早期發(fā)生遷移、克隆性增殖和表型轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致病理性動(dòng)脈內(nèi)膜增厚，促進(jìn)斑塊周?chē)仔原h(huán)境形成[18]。人類(lèi)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中TET2和5-羥甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5-hmC）含量下降，TET2基因敲除可導(dǎo)致平滑肌收縮標(biāo)志物表達(dá)減少和KLF4表達(dá)增加[19]，平滑肌細(xì)胞KLF4敲除則可有效縮小小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊體積[20]。

平滑肌細(xì)胞增殖引起的血管重塑是動(dòng)脈粥樣硬化的中間病理改變[21]。DNMTs基因敲除或抑制引起TET2基因啟動(dòng)子內(nèi)高甲基化喪失，促進(jìn)其表達(dá)，從而抑制小鼠體外血管平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移和去分化，從而延緩血管重塑[22]。DNMT1抑制誘導(dǎo)磷酸酶張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）基因啟動(dòng)子低甲基化，促進(jìn)其表達(dá)，從而增強(qiáng)平滑肌分化改善血管重塑[23]。血管重塑導(dǎo)致細(xì)胞核局部黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）活化以及由細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)定位，增加DNMT3A表達(dá)和5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5-mC）水平，提高收縮基因啟動(dòng)子DNA甲基化水平從而減少其表達(dá)，導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞向去分化以及合成的表型轉(zhuǎn)換[24]。

1.3 單核細(xì)胞募集與巨噬細(xì)胞極化 動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的巨噬細(xì)胞源于血液中單核細(xì)胞的募集、分化和增殖[25]，炎癥消退能力受損是動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展的重要原因[26]，主要由巨噬細(xì)胞不成比例的極化驅(qū)動(dòng)[27]。

人類(lèi)頸動(dòng)脈斑塊中信號(hào)淋巴細(xì)胞激活分子家族成員7（signaling lymphocytic activation molecule 7，SLAM7）基因啟動(dòng)子低甲基化，SLAM7表達(dá)增加且集中于富含CD68+的巨噬細(xì)胞[28]，與M1極化表型引發(fā)和維持炎癥、表達(dá)CD68+并分泌促炎因子的特征相符[29]。

DNMT1可提高小鼠斑塊巨噬細(xì)胞過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor-γ，PPARγ）基因啟動(dòng)子內(nèi)位點(diǎn)甲基化水平，促進(jìn)巨噬細(xì)胞活化及斑塊進(jìn)展[30]。DNMT1在人類(lèi)和小鼠頸動(dòng)脈斑塊中表達(dá)均增加，引起KLF4啟動(dòng)子內(nèi)位點(diǎn)甲基化水平升高，抑制KLF4表達(dá)，從而使巨噬細(xì)胞向“促炎”表型轉(zhuǎn)換[31]。TET2失活導(dǎo)致NOD樣受體蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體活性增強(qiáng)，促進(jìn)炎性因子產(chǎn)生[32]。

動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的多種細(xì)胞響應(yīng)表型調(diào)節(jié)，了解細(xì)胞特異性DNA甲基化及表達(dá)改變有助于理解細(xì)胞功能，探索干預(yù)靶點(diǎn)。

2 動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的外周血DNA甲基化

外周血白細(xì)胞參與免疫反應(yīng)，使得血液中炎癥因子、脂質(zhì)等成分可以調(diào)節(jié)動(dòng)脈壁細(xì)胞反應(yīng)[26]。由于動(dòng)脈粥樣硬化斑塊取材的局限性，目前研究主要以外周血為樣本，分析外周血DNA甲基化相關(guān)研究有助于系統(tǒng)理解動(dòng)脈粥樣硬化性疾病。

2.1 DNA甲基化在白細(xì)胞亞型中的改變 有研究顯示，急性心肌梗死患者外周血淋巴細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量高、外排減弱，炎癥因子及硫酸基轉(zhuǎn)移酶2B1b（sulphotransferase 2B1b，SULT2B1b）基因表達(dá)增加，SULT2B1b啟動(dòng)子甲基化比例以及DNMT3A、DNMT3B表達(dá)水平低于健康人群，提示SULT2B1b啟動(dòng)子低甲基化可降低SULT2B1b轉(zhuǎn)錄，并導(dǎo)致淋巴細(xì)胞內(nèi)膽固醇積累伴炎癥加重以及冠心病進(jìn)展[33]。

AT豐富結(jié)構(gòu)域5B基因（AT-richinteractive domain 5B，ARID5B）內(nèi)cg25953130位點(diǎn)甲基化水平與表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，ARID5B敲低導(dǎo)致脂質(zhì)代謝和炎癥反應(yīng)基因表達(dá)下降，從而抑制單核細(xì)胞遷移和吞噬[34]。葉酸可拮抗高同型半胱氨酸血癥和高脂血癥引起的全基因組DNA低甲基化和ARID5B高表達(dá)，抑制單核細(xì)胞分化[35]。冠心病患者外周血中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞5-mC水平較健康人群降低，但僅在單核細(xì)胞中有顯著差異，伴5-hmC增加和DNMT1表達(dá)下降[36]。

冠心病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）中5-mC和5-hmC水平與頸動(dòng)脈和冠狀動(dòng)脈粥樣硬化水平呈正相關(guān)[37]，TET2表達(dá)顯著增加[38]，巨噬細(xì)胞極化相關(guān)基因位點(diǎn)內(nèi)具有明顯的甲基化水平差異[39]，提示單核細(xì)胞DNA甲基化與動(dòng)脈粥樣硬化性疾病間的關(guān)系需進(jìn)一步研究。

2.2 外周血全基因組中的DNA甲基化特征DNA甲基化水平改變與動(dòng)脈粥樣硬化病變程度有關(guān)，其差異性位點(diǎn)多出現(xiàn)于炎癥、氧化應(yīng)激、糖代謝等反應(yīng)途徑。高血壓患病率高的非洲裔美國(guó)人外周血白細(xì)胞全基因組DNA中4個(gè)甲基化位點(diǎn)與未來(lái)多部位動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)[40]。動(dòng)脈粥樣硬化患者外周血白細(xì)胞中N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenine，m6A）水平與頸動(dòng)脈斑塊的大小和厚度呈負(fù)相關(guān)，與α-酮戊二酸/鐵依賴性雙加氧酶同源蛋白1（AlkB homolog 1，ALKBH1）基因表達(dá)上調(diào)有關(guān)[41]。冠心病患者IL-6基因啟動(dòng)子特異性位點(diǎn)甲基化水平降低，IL-6mRNA表達(dá)增加[42]。早發(fā)性顱內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化性狹窄患者外周血白細(xì)胞中差異性甲基化位點(diǎn)與炎癥、糖代謝等過(guò)程有關(guān)，其中環(huán)指蛋白213（ring finger protein 213，RNF213）基因內(nèi)cg22443212位點(diǎn)具有顯著高甲基化水平，該基因調(diào)節(jié)血管壁發(fā)育并與免疫和炎癥相關(guān)[43]。

全表觀基因組關(guān)聯(lián)研究（epigenomewide association studies，EWAS）有助于判斷特定基因DNA甲基化模式與發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)間的關(guān)系[44]，相關(guān)差異甲基化位點(diǎn)可作為評(píng)價(jià)靶點(diǎn)[45-46]。線粒體DNA拷貝數(shù)（mtDNA-C）可能通過(guò)修飾細(xì)胞核DNA甲基化調(diào)節(jié)核基因表達(dá)影響心血管疾病發(fā)病機(jī)制[47]。有研究表明，芳香烴受體抑制因子（aryl hydrocarbon receptor repressor gene，AHRR）基因啟動(dòng)子上游的差異甲基化區(qū)域與多個(gè)社區(qū)人群隊(duì)列的頸動(dòng)脈內(nèi)膜厚度相關(guān)[48]。頸動(dòng)脈斑塊患者外周血Smad家族因子7（Smad family member 7，SMAD7）基因啟動(dòng)子內(nèi)位點(diǎn)甲基化水平較高，且與頸動(dòng)脈斑塊評(píng)分呈正相關(guān)[49]。有研究表明，脂質(zhì)可引起血液細(xì)胞DNA甲基化改變，但尚未觀察到DNA甲基化調(diào)節(jié)血脂水平的證據(jù)[50]。

外周血特定白細(xì)胞亞型中差異表達(dá)的基因可能在局部斑塊形成、血液物質(zhì)代謝、系統(tǒng)炎癥反應(yīng)中起重要作用，然而DNA甲基化調(diào)節(jié)可能改變循環(huán)系統(tǒng)中細(xì)胞的數(shù)量和比例，全血樣本細(xì)胞異質(zhì)組成可影響檢測(cè)結(jié)果。因此，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)可能有助于探索動(dòng)脈粥樣硬化病因，補(bǔ)充其發(fā)生發(fā)展的時(shí)間和空間機(jī)制，其與EWAS的結(jié)合需進(jìn)一步探索。

3 大動(dòng)脈粥樣硬化型卒中與DNA甲基化改變

大動(dòng)脈粥樣硬化（large-artery atherosclerosis，LAA）型卒中是缺血性卒中的主要亞型[51]，盡管未觀察到缺血性卒中亞型間全基因組DNA甲基化水平的顯著差異[52]，但是LAA相關(guān)DNA甲基化改變已被報(bào)道。

3.1 炎癥與氧化應(yīng)激 LAA型卒中急性期外周血MTRNR2L8基因啟動(dòng)子周?chē)町愋约谆稽c(diǎn)低甲基化，該基因編碼多肽分子，具有神經(jīng)保護(hù)、抗凋亡及抗炎作用，其甲基化水平對(duì)預(yù)后具有預(yù)測(cè)作用[53]。動(dòng)脈粥樣硬化性卒中及TIA發(fā)作患者外周血單核細(xì)胞、B細(xì)胞及T細(xì)胞中自身免疫調(diào)節(jié)蛋白1（autoimmune regulator type 1，AIRE1）和花生四烯酸12-脂加氧酶（arachidonate 12-lipoxygenase，ALOX12）啟動(dòng)子甲基化水平升高，其中單核細(xì)胞中基因甲基化程度顯著低于B、T細(xì)胞，提示單核細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展的炎癥機(jī)制中可能發(fā)揮更重要的作用[54]。卒中急性期患者外周血白細(xì)胞中髓過(guò)氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）基因甲基化水平顯著降低，可能與中性粒細(xì)胞炎癥和氧化應(yīng)激途徑有關(guān)[55]。

3.2 血脂代謝 LAA患者外周血細(xì)胞DNA中甲基化差異性位點(diǎn)與脂代謝相關(guān)[56]。缺血性卒中患者外周血白細(xì)胞中ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白G1（ATP-binding cassette G1，ABCG1）基因啟動(dòng)子內(nèi)位點(diǎn)高甲基化，且在女性中更為顯著[57]。全血細(xì)胞總DNA中載脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）基因啟動(dòng)子內(nèi)位點(diǎn)高甲基化與我國(guó)漢族人群動(dòng)脈粥樣硬化性卒中有關(guān)[58]。動(dòng)脈粥樣硬化性卒中患者外周血白細(xì)胞microRNA223基因啟動(dòng)子內(nèi)9個(gè)位點(diǎn)甲基化水平低于健康人群，且與血TG水平呈正相關(guān)[59]。

3.3 斑塊不穩(wěn)定 動(dòng)脈粥樣硬化性卒中患者M(jìn)MP24基因cg04316754位點(diǎn)在不穩(wěn)定斑塊（潰瘍斑塊）中甲基化程度較在穩(wěn)定斑塊中更高[60]。相比未發(fā)生急性血管事件的頸動(dòng)脈斑塊患者，卒中或TIA患者頸動(dòng)脈斑塊中脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2（lipoprotein-associated phospholipase A2，Lp-PLA2）編碼基因PLA2G7啟動(dòng)子甲基化水平顯著降低，Lp-PLA2表達(dá)增加[61]。

3.4 二級(jí)預(yù)防藥物療效 卒中后阿司匹林治療期間復(fù)發(fā)患者鎂依賴性蛋白磷酸酶1A（protein phosphatase magnesium dependent 1A，PPM1A）基因內(nèi)cg04985020位點(diǎn)具有較高的甲基化水平[62]。卒中后氯吡格雷治療期間復(fù)發(fā)患者腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子3（tumor necrosis factor receptorassociated factor 3，TRAF3）基因內(nèi)cg03548645位點(diǎn)DNA甲基化水平顯著降低，且與CYP2C19基因型無(wú)關(guān)[63]。CYP2C19*1/*1型卒中患者ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族b亞家族成員1（ATP-binding cassette subfamily B member 1，ABCB1）低甲基化與較低藥物吸收率、較高血小板反應(yīng)性以及缺血事件風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)[64]。

動(dòng)脈粥樣硬化是始于局部斑塊的系統(tǒng)性疾病[65]，特異位點(diǎn)及全基因組水平的DNA甲基化改變可能是疾病的原因或后果，且與遺傳、環(huán)境等多個(gè)內(nèi)外源因素密切相關(guān)。由于血管組織學(xué)來(lái)源、樣本細(xì)胞組成、局部微環(huán)境代謝狀態(tài)及病變階段均會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果，因此迫切需要更多研究提供DNA甲基化水平改變與動(dòng)脈粥樣硬化尤其是臨床血管事件發(fā)作、進(jìn)展與治療、預(yù)后之間的關(guān)系，以明確DNA甲基化的響應(yīng)和調(diào)節(jié)機(jī)制，為診療提供新的思路。