提取方法對玉木耳多糖結構及抗氧化活性的影響

王楠，張閃閃，陳玥彤，劉婷婷*

1. 吉林農業大學食品科學與工程學院（長春 130118）；2. 農業農村部食用菌加工技術集成科研基地（長春 130118）；3. 吉林省糧食精深加工與高效利用工程研究中心（長春 130118）；4. 吉林省糧食精深加工與副產物高效利用技術創新重點實驗室（長春 130118）

玉木耳（Auricularia corneaEhrenb.），屬木耳科木耳屬，是毛木耳的白色變異菌株[1]，是一種營養價值較高的食藥用菌。玉木耳多糖（Auricularia corneaEhrenb. polysaccharide，ACEP）含量約為6.56%，是玉木耳中主要活性成分。相關研究表明，玉木耳多糖具有抗氧化[2]、抗炎[3]、抗疲勞[4]等多種功能。

近年來關于玉木耳多糖的研究主要集中于提取方法及其生物活性等方面的研究。羅敬文等[2]利用水提醇沉法得到玉木耳多糖并測定其抗氧化活性及其對大腸桿菌的抑制能力；王秀秀[3]采用蝸牛酶提取法提取玉木耳多糖并證明其具有抗氧化、抗炎癥等生物活性；金鳳石[4]利用高壓蒸煮法提取玉木耳多糖并研究其抗疲勞特性。由于玉木耳等食用菌自身的復雜結構，多糖被包裹于細胞壁內，為了提高多糖的提取率以及生物活性，相關研究學者常采用一些輔助方法，如超聲波、高溫高壓、酶解等。范金波等[5]利用超聲波輔助酶法提取黑木耳多糖并確定其最佳提取工藝。黃秀錦[6]利用酶法提取銀耳多糖溶液，并分析了其抗氧化活性。黃曉德等[7]采用高溫高壓法提取銀耳子實多糖，確定其最佳提取工藝下的提取率為36.5%。

加壓熱水浸提是在氮氣的保護下，以高壓蒸煮法為基礎，利用高溫和壓力對物料的細胞壁結構進行破壞，提取高生物活性物質的方法[8]。酶解-加壓熱水浸提協同提取法是一種酶解聯合加壓熱水浸提的生物活性物質的技術，具備用時短、耗能少、制備的玉木耳多糖生物活性高等優點。現在關于不同提取方法對玉木耳多糖提取率及其生物活性的影響的系統性報道還相對較少。

試驗以玉木耳為原料，采用5種方法（ACE-R、ACE-J、ACE-M、ACE-MJ、ACE-MR）提取玉木耳多糖，研究不同提取方法對玉木耳多糖提取率、理化特性、結構特征及體外抗氧化活性的影響，篩選出制備抗氧化活性高的玉木耳多糖的最適宜提取方法，以期為玉木耳的功能性開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉木耳，市售；纖維素酶，美國Sigma公司；DPPH試劑，美國Sigma公司；鄰苯三酚等其他試劑均為分析純，國藥集團化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

UWave-1000高壓反應釜（上海新儀微波科技公司）；IR RESTIGE-21傅里葉變換紅外光譜儀（日本島津公司）；SSE-550掃描電子顯微鏡（日本島津公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 玉木耳粗多糖的提取

1.3.1.1 ACE-R提取玉木耳多糖

準確稱取10 g粒徑0.106 mm玉木耳粉，按料液比1∶100（g/mL）加入蒸餾水，于90 ℃提取6 h，重復提取2次，離心（4 000 r/min，20 min），上清液采用Sevag法脫蛋白，濃縮后于4 ℃醇沉12 h（95%乙醇溶液），離心（4 000 r/min，20 min），沉淀凍干即為玉木耳粗多糖ACEP-1。

1.3.1.2 ACE-M提取玉木耳多糖

準確稱取10 g粒徑0.106 mm玉木耳粉，按料液比1∶100（g/mL）加入蒸餾水，加入1.0%的纖維素酶，pH 5.0，于50 ℃提取120 min，于100 ℃滅活15 min，后續操作同1.3.1.1，即為玉木耳粗多糖ACEP-2。

1.3.1.3 ACE-J提取玉木耳多糖

準確稱取10 g粒徑0.106 mm玉木耳粉，按料液比1∶100（g/mL）加入蒸餾水，在高壓反應釜內提取，壓力為2.0 MPa，溫度為100 ℃，時間為55 min，后續操作同1.3.1.1，即為玉木耳粗多糖ACEP-3。

1.3.1.4 ACE-MR提取玉木耳多糖

準確稱取10 g粒徑0.106 mm玉木耳粉，按料液比1∶100（g/mL）加入蒸餾水，加入1.0%的纖維素酶，pH 5.0，于50 ℃提取120 min，于100 ℃滅活15 min，將酶解后的樣液在90 ℃下提取6 h，后續操作同1.3.1.1，即為玉木耳粗多糖ACEP-4。

1.3.1.5 ACE-MJ提取玉木耳多糖

準確稱取10 g粒徑0.106 mm玉木耳粉，按料液比1∶100（g/mL）加入蒸餾水，加入1.0%的纖維素酶，pH 5.0，于50 ℃提取120 min，于100 ℃滅活15 min，將酶解后的樣液放入高壓反應釜內提取，溫度為100℃，壓力為2.0 MPa，反應時間為55 min，后續操作同1.3.1.1，即為玉木耳粗多糖ACEP-5。

1.3.2 玉木耳多糖提取率的測定

參考張閃閃等[8]的方法，將玉木耳多糖提取液稀釋到一定質量濃度，用苯酚-硫酸法測其多糖含量，玉木耳多糖提取率按式（1）計算。

式中：m1為根據標準曲線計算的玉木耳多糖質量，mg；n為稀釋倍數；v1為玉木耳多糖提取液的體積，mL；m為玉木耳粉的質量，mg；v2為吸取稀釋玉木耳多糖提取液的體積，mL。

1.3.3 玉木耳多糖理化特性的測定

1.3.3.1 溶解性的測定

稱取0.1 g玉木耳多糖，分別加入50 mL的蒸餾水、乙醇、丙酮和無水乙醚等溶劑，觀察其溶解性。

1.3.3.2 碘-碘化鉀試驗

參照董英等[9]的方法，檢測多糖中是否含有淀粉。

1.3.3.3 三氯化鐵試驗

參照劉婷婷等[10]的方法，取1 mL的玉木耳多糖溶液（1 mg/mL）與三氯化鐵混勻，觀察顏色變化。

1.3.3.4 斐林試劑試驗

參照陳慧[11]的方法，將1 mL玉木耳多糖溶液（10 mg/mL）與4 mL斐林試劑混勻，沸水浴反應15 min，觀察有無紅色沉淀出現。

1.3.3.5 硫酸-咔唑試驗

參照劉瑩等[12]的方法，檢測多糖中是否存在糖醛酸。

1.3.4 玉木耳多糖紅外光譜的測定

參照楊嘉丹等[13]的方法，準確稱取2 mg玉木耳多糖，加入200 mg烘干至恒重的KBr，研磨壓片，在4 000～400 cm-1范圍進行紅外掃描。

1.3.5 玉木耳殘渣的掃描電鏡觀察

使用掃描電鏡觀察玉木耳粉和ACE-R、ACE-J、ACE-M、ACE-MJ、ACE-MR玉木耳殘渣的微觀結構。

1.3.6 玉木耳多糖體外抗氧性化測定

將5種多糖配制成不同質量濃度（0.5，1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 mg/mL）的多糖樣液進行DPPH、超氧陰離子和羥基自由基清除能力的測定，分別參考文獻[14]、[8]和[15]進行。

1.4 數據統計分析

采用Origin 8.5軟件繪制圖形，Excel 2016、Spss 8.0.6軟件進行分析作圖。試驗均重復3次，數據以平均值±標準差（±s）表示誤差。

2 結果與分析

2.1 提取方法對玉木耳多糖提取率的影響

如表1所示，多糖提取率由高到低依次為ACE-MJ＞ACE-MR＞ACE-J＞ACE-R＞ACE-M，其中ACE-MJ的多糖提取率最高，為34.95%±0.07%。原因可能是先用纖維素酶對玉木耳的細胞壁結構進行酶解破壞，然后在氮氣保護下，利用高溫和壓力進一步加快物料細胞壁破壞，加速溶劑滲透與多糖擴散速度，增大多糖的提取率。

表1 提取方法對玉木耳多糖提取率的影響

2.2 提取方法對玉木耳多糖理化特性的影響

由表2可知，5種方法提取的玉木耳多糖均溶于蒸餾水，不溶于乙醇、丙酮和乙醚等有機溶劑；碘-碘化鉀反應、三氯化鐵反應和斐林試劑反應均呈陰性，表明多糖中無淀粉、酚類物質和還原糖存在；硫酸-咔唑反應呈陽性，表明多糖中有糖醛酸存在。

表2 提取方法對玉木耳多糖理化特性的影響

2.3 玉木耳多糖紅外光譜分析

由圖1可知，5種方法提取的玉木耳多糖均具有糖類化合物特征峰，且具有相似的紅外特征峰，表明不同提取方法對玉木耳多糖的初級結構無明顯影響。其中3 380 cm-1處的吸收峰是O—H伸縮振動引起的，分子間氫鍵的存在使其峰形變寬[16]。在2 920 cm-1處的吸收峰是亞甲基（—CH2—）中的C—H伸縮與變角振動引起的，是多糖物質的特征吸收峰[17]。在1 620 cm-1和1 420 cm-1處的振動峰是羰基C＝O和C—O伸縮振動引起的，說明多糖中含有糖醛酸[18]。在1 380 cm-1處的吸收峰是甲基C—H的彎曲振動峰，與C—H的伸縮振動構成了糖環的特征吸收[19]。在1 250 cm-1處是O—H鍵伸縮振動，在1 080 cm-1處是C—O伸縮振動，該物質中含有吡喃環。在895 cm-1處的吸收峰說明多糖含有β-糖苷鍵。

圖1 玉木耳多糖的紅外光譜圖

2.4 提取方法對玉木耳粉末微觀結構的影響

由圖2（A）觀察到，玉木耳粉表面平滑，偶有因機械破碎產生的小顆粒堆積在其平滑表面，表觀形貌較完整。由圖2（B）觀察到，ACE-M玉木耳殘渣表面受到輕微破壞，出現一些細小裂隙，這是因為纖維素酶對其細胞壁結構造成了破壞，進而促使多糖溶出。由圖2（C）觀察到，ACE-R玉木耳殘渣表面的裂隙增多且加深，有碎片堆積在表面，這是因為ACE-R促進溶劑緩慢進入細胞壁，改變細胞壁內外滲透壓，促使多糖溶出。由圖2（D）觀察到，ACE-J玉木耳殘渣表面受破壞程度較前兩者更嚴重，表面凹凸不平，裂紋深且密，碎片增多，可能是因為在氮氣的保護下，高壓高溫使細胞壁大幅度破裂，增加了多糖提取率。由圖2（E）觀察到，ACE-MR玉木耳殘渣表面遭到破壞程度更大，裂紋橫貫表面，裂隙深且明顯，這是因為先利用纖維素酶對其細胞壁進行酶解后，再通過ACE-M協同提取，加速了溶劑滲透和多糖的溶出。由圖2（F）觀察到，ACE-MJ玉木耳殘渣表面受破壞程度最為嚴重，從內層到外層翻卷起大量的碎片，裂隙又深又密，內部區域暴露更多，形成更為復雜的空間結構，這是因為在氮氣的保護下，酶法結合高溫高壓處理，細胞壁被嚴重破壞。綜上表明不同提取方法對玉木耳殘渣表觀結構破壞程度不一樣，致使其多糖提取率也有明顯差異。

圖2 玉木耳粉及5種方法提取后的玉木耳殘渣的掃描電鏡圖

2.5 提取方法對玉木耳多糖抗氧化性的影響

玉木耳多糖的體外抗氧化活性結果如圖3所示。5種方法提取的玉木耳多糖均具有較好的抗氧化活性。由圖3（a）可知，在0.5～3.0 mg/mL之間，DPPH自由基清除能力隨多糖濃度升高而增強，呈正相關關系；在2.0 mg/mL時，ACEP-1、ACEP-2、ACEP-4和ACEP-5對DPPH自由基的清除能力均已達到50%以上；其中ACEP-2的清除能力與VC最為接近。由圖3（b）可知，在0.5～2.5 mg/mL之間，羥基自由基清除率隨多糖濃度的升高而顯著增強，呈劑量依賴關系；但質量濃度大于2.5 mg/mL時，其清除率隨濃度的增大趨勢漸趨平緩。當質量濃度為3.0 mg/mL時，ACEP-2清除羥基自由基的能力最強，清除率為72.14%。由圖3（c）可知，在0.5～1.5 mg/mL之間，隨多糖濃度的增加其自由基清除能力迅速增強；在1.5～3.0 mg/mL之間，自由基清除能力逐漸趨于平穩。在0.5～3.0 mg/mL之間，ACEP-2和ACEP-5清除超氧陰離子自由基的能力相近；在3.0 mg/mL時，清除率能力由高到低依次為ACEP-2（70.16%）＞ACEP-5（68.21%）＞ACEP-4（65.13%）＞ACEP-1（64.87%）＞ACEP-3（56.65%）。

圖3 提取方法對玉木耳多糖體外抗氧化的影響

3 結論

試驗主要利用ACE-R、ACE-M、ACE-J、ACEMR和ACE-MJ 5種方法制備玉木耳多糖，其中ACEMJ提取率最高，為34.95%±0.07%。理化結果表明，5種玉木耳多糖均溶于蒸餾水，不溶于乙醇、丙酮和乙醚等有機溶劑；碘-碘化鉀、三氯化鐵和斐林試劑反應均呈陰性，表明玉木耳多糖中不存在淀粉、酚類物質及還原糖類；硫酸-咔唑反應呈陽性，表明玉木耳多糖中有糖醛酸存在。傅里葉紅外光譜顯示，5種方法提取的玉木耳多糖均具有相似的糖類化合物紅外特征峰。掃描電鏡分析顯示，不同提取方法對玉木耳殘渣粉末表觀結構破壞程度不一樣，其玉木耳多糖提取率也有明顯差異，其中ACE-MJ對玉木耳粉末表觀破壞最為嚴重，其多糖提取率也最高。體外抗氧化結果表明，5種方法提取的玉木耳多糖對DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥基自由基均有一定的清除作用，其中ACEP-2的抗氧化能力最強，ACEP-5次之，二者均能夠較好地保留多糖的生物活性，綜合考慮提取率、抗氧化活性，ACE-MJ為最優方法。該研究可為玉木耳多糖高效制備及其作為功能因子的研究提供一定的理論基礎。