miR-122對腦缺血再灌注損傷小鼠腦梗死體積及胰島素樣生長因子-1受體通路的影響

廖曉斌 劉子彪 呂志成 康承湘

（郴州市第一人民醫(yī)院，郴州 423000）

腦卒中在人群中的發(fā)病率逐年上升[1]。腦卒中溶栓治療后可發(fā)生腦缺血再灌注損傷（ischemia/reperfusion，I/R），極易誘導(dǎo)腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡或多種腦組織損害。I/R 是由多因素參與的一種較為復(fù)雜的級聯(lián)反應(yīng)，包括氧自由基作用、炎癥反應(yīng)、鈣濃度增加等[2-3]。miR-122 是機體組織特異性微小RNA，參與機體神經(jīng)發(fā)育，在腦組織缺血、缺氧及腦梗死的發(fā)生過程中都有調(diào)節(jié)作用，與腦梗死的病情和預(yù)后直接相關(guān)[4]。miR-122 與缺血再灌注損傷的發(fā)生密切相關(guān)，如小鼠腦缺血再灌注中，miR-122 對降低胰島素樣生長因子-1 受體（insulin like growth factor-1 receptor，IGF-1R）表達(dá)起調(diào)控作用，降低腦細(xì)胞的損傷[5]。近年來，研究表明IGF-1R 通路紊亂與腦部各種損傷疾病，如糖尿病腦病、阿爾茨海默病、癲癇等也存在一定關(guān)聯(lián)。IGF 包含3 類肽類激素，如IGF-1、IGF-2 等[6-7]，而IGF-1 及其受體IGF-1R 在機體組織中存在較廣，尤其是在腦組織中，IGF-1 可與受體結(jié)合，激活下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而抑制腦部神經(jīng)細(xì)胞凋亡，促進存活，在改善動物和人腦損傷中有重要意義，有效控制IGF-1R 信號紊亂，能明顯促進神經(jīng)元損傷的恢復(fù)[8-9]。由此，本研究旨在探討miR-122 對腦缺血再灌注損傷小鼠腦梗死面積及IGF-1R 通路的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

TRIzol 試劑（浙江AMEKO）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（武漢，賽維爾）；RT-PCR 試劑盒（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）；SPF 級雄性 C57BL 小鼠（長沙，天勤生物），體質(zhì)量23.51 g±1.47 g，11 周齡，自由飲食、飲水，溫度24℃±1℃，濕度50%左右。

1.2 分組處理

40 只小鼠分為對照組（假手術(shù)組）、模型組（I/R 模型組）、模擬物組（I/R 模型+miR-122 模擬物）、抑制物組（I/R 模型+miR-122 抑制物）。用10% 水合氯醛腹腔注射麻醉模擬物組、抑制物組小鼠，麻醉后固定于腦定位儀上，取7 μL 的miR-122 模擬物、miR-122 抑制物混懸液分別注射至模擬物組、抑制物組小鼠左側(cè)腦室，速度3 μL/min，留針5 min。

1.3 模型制備

線栓法制備I/R 模型。動物術(shù)前禁食12 h，可飲水，選用戊巴比妥鈉30 g/L 進行腹腔注射麻醉。術(shù)區(qū)消毒切開頸部皮膚，左側(cè)頸總動脈小切口，將0.18 mm 經(jīng)處理過的線栓于頸總動脈深入頸內(nèi)動脈，直至腦部中動脈，有輕微阻力即可停止深入。缺血1 h 后撤除線栓。術(shù)中保持小鼠肛溫處于36℃～37℃。對照組分離頸動脈后縫合。

1.4 神經(jīng)行為學(xué)檢測

撤除線栓后，觀察小鼠行為改變，行阿撲嗎啡旋轉(zhuǎn)誘導(dǎo)實驗，統(tǒng)計用藥30 min 內(nèi)小鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)，計算平均旋轉(zhuǎn)圈數(shù)。末次給藥結(jié)束后行懸掛實驗，將小鼠前肢懸掛于距地面30 cm 水平放置的金屬絲上，記錄從開始懸掛至落地時的時間并評分。評分標(biāo)準(zhǔn)為：持續(xù)0～5 s 記為0 分，6～10 s 記為1 分；11～15 s 記為2 分，16～20 s 記 為3 分，21～25 s 記為4 分，26～30 s 記為5 分，超過30 s 記為6 分。共檢測3 次，取平均值，每次檢測時間間隔約為2 min。

1.5 Morris 水迷宮實驗

每組小鼠取10 只進行Morris 水迷宮實驗。

記憶訓(xùn)練期（第1、2 天）：將小鼠面朝池壁放入水中游泳60 s，第1 天引導(dǎo)小鼠登上平臺，第2天若在60 s 內(nèi)動物沒有登上平臺則繼續(xù)引導(dǎo)其登上平臺，停留15 s 后放入溫暖干燥的籠子結(jié)束訓(xùn)練。

記憶增強期（第3、4、5 天）：每只動物每天早、晚各1 次實驗，每次分別從除平臺所在方位外的3個方位各放1 次，每只動物放入水中的間隔時間為15 s。動物單次游泳時間為60 s，若小鼠在60 s 內(nèi)不能上臺則引導(dǎo)其登上平臺適應(yīng)15 s 后進行下次實驗。最后，將小鼠擦干放入鼠籠。

空間探索實驗（第6 天）：撤出平臺，將小鼠從與平臺相對的方位面朝池壁放入水中，讓小鼠自由游泳60 s 后將動物擦干放入鼠籠。觀察小鼠在平臺所有象限的距離百分比（PT%）和停留時間百分比（T%），以此來評價藥物對小鼠神經(jīng)行為學(xué)障礙的影響（PT%和T%值越大，表明大鼠的認(rèn)知記憶能力越強）。

1.6 小鼠腦梗死體積檢測

2 周后麻醉處死小鼠取腦，將取出的腦組織冷凍30 min，對腦組織間隔2 mm 做6 個冠狀切片，并采用10%的2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）進行水浴染色，正常組織呈紅色，缺血壞死呈白色，用NIS—Elements BR3.0 基礎(chǔ)研究圖像分析軟件對切片腦梗死體積進行測定。采用單盲法，即盲圖像分析，計算腦梗死灶體積。

1.7 H-E 染色

取各組小鼠腦組織，固定于多聚甲醛溶液中，用石蠟包埋腦組織，切成5 μm 的薄片，H-E 染色組織薄片，封片后顯微鏡下觀察組織病理學(xué)變化。

1.8 RT-PCR 檢測miR-122、IGF-1R 水平

將胰蛋白酶加入小鼠腦組織中進行消化反應(yīng)，PBS 沖洗，然后滴入0.9%NaCl 溶液，總RNA 采用TRIzol 法來提取，總RNA 再反轉(zhuǎn)錄成 cDNA。實驗步驟按試劑說明書操作，用DNA 熒光染料SYBR Green Ⅰ對miR-122、IGF-1R mRNA 表達(dá)水平進行檢測，內(nèi)參采用β-actin，60℃ 10 min，95℃ 72℃，各 30 s、95℃，5 min，循環(huán)次數(shù)40，用相對定量2-ΔΔCT計 算miR-122、IGF-1R mRNA 表 達(dá) 量。實驗次數(shù)至少3 次。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.9 免疫印跡檢測IGF-1R 蛋白表達(dá)

取出各組小鼠腦組織，稱重后剪碎組織，用裂解液裂解組織成組織懸液，13 000 r/min 離心15 min，收集上清液，用BCA 法對總蛋白濃度進行測定。完成配膠、電泳分離蛋白，以marker 確定目標(biāo)蛋白位置、轉(zhuǎn)膜、洗膜、封閉液室溫封閉，分別孵育一、二抗，用ECL 發(fā)光劑顯影曝光，分析目標(biāo)蛋白灰度值，并用各自的內(nèi)參校正。

1.10 流式細(xì)胞術(shù)檢測神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況

取腦組織加入裂解液，制備細(xì)胞懸液，對其進行洗滌2 次，離心5 min，選擇100 μL 的1×結(jié)合緩沖液，進行重懸細(xì)胞操作，用5 μL 標(biāo)記FITC的Annexin Ⅴ與5 μL PI 染色液混勻，避光孵育15 min 后加入400 μL 結(jié)合緩沖液，混勻，洗滌3 次后上機檢測。

1.11 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩組間比較采用LSD-t檢驗，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠神經(jīng)功能比較

與對照組相比，模型組和模擬物組小鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)明顯增多，懸掛實驗評分降低，且模擬物組小鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)多于模型組，懸掛實驗評分低于模型組（P<0.05）；與模型組相比，抑制物組小鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)明顯減少，懸掛試驗評分明顯升高（P<0.05）（表1）。

表1 各組小鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)和評分比較（n=10，±s）

表1 各組小鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)和評分比較（n=10，±s）

△P<0.05 vs 對照組；*P<0.05 vs 模型組；#P<0.05 vs 模擬物組

組別 旋轉(zhuǎn)圈數(shù)（圈） 懸掛實驗評分對照組 5.02±1.10 1.17±0.31模型組 12.35±3.24△ 0.53±0.16△模擬物組 15.37±4.46△* 0.32±0.13△*抑制物組 7.21±1.57△*# 0.93±0.28△*#

2.2 小鼠認(rèn)知功能比較

與對照組相比，模型組和模擬物組小鼠PT%、T%值均降低，且模擬物組較模型組降低的更為顯著（P<0.05）；與模型組相比，抑制物組小鼠PT%、T%值顯著升高（P<0.05）（表2）。

表2 各組大鼠PT%、T%比較（n=10，±s）

表2 各組大鼠PT%、T%比較（n=10，±s）

△P<0.05 vs 對照組；*P<0.05 vs 模型組；#P<0.05 vs 模擬物組

組別 PT（%） T（%）對照組 40.23±5.54 35.19±4.32模型組 26.14±3.01△ 25.51±3.68△模擬物組 21.56±2.72△* 20.23±2.71△*抑制物組 35.27±4.16△* 31.72±3.18△*

2.3 小鼠腦梗死體積

對照組小鼠腦組織無梗死。與對照組相比，模型組（45.13±5.22）mm3和模擬物組（61.08±10.31）mm3小鼠腦梗死體積顯著增加，且模擬物組小鼠腦梗死體積大于模型組（P<0.05）；與模型組相比，抑制物組（28.67±8.18）mm3小鼠腦梗死體積顯著減少（P<0.05）（圖1）。

圖1 小鼠腦梗死體積比較。

2.4 腦組織神經(jīng)元形態(tài)

H-E 染色顯示對照組腦組織結(jié)構(gòu)完整，神經(jīng)元排列緊密，無染色不勻現(xiàn)象；模型組腦組織神經(jīng)元排列呈疏松狀態(tài)，著色不勻，有大量空泡樣病理結(jié)構(gòu)改變；模擬物組腦組織結(jié)構(gòu)改變較模型組嚴(yán)重；抑制物組腦組織損傷病理變化逐漸減弱，神經(jīng)元排列較密，空泡樣病理改變減少（圖2）。

圖2 腦組織H-E 染色，×200。

2.5 腦組織miR-122、IGF-1R mRNA 水平變化

與對照組相比，模型組和模擬物組miR-122 水平均顯著增加，IGF-1R mRNA 水平均顯著降低，且模擬物組中miR-122、IGF-1R mRNA 變化較模型組顯著（P<0.05）；與模型組相比，抑制物組miR-122 水平顯著降低，IGF-1R mRNA 水平顯著升高（P<0.05）（表3）。

表3 各組小鼠腦組織中miR-122、IGF-1R mRNA水平比較（n=10，±s）

表3 各組小鼠腦組織中miR-122、IGF-1R mRNA水平比較（n=10，±s）

△P<0.05 vs 對照組；*P<0.05 vs 模型組；#P<0.05 vs 模擬物組

組別 miR-122 IGF-1R對照組 2.71±0.13 1.68±0.10模型組 4.98±0.16△ 0.73±0.15△模擬物組 7.11±0.18△* 0.52±0.13△*抑制物組 2.03±0.14△*# 1.01±0.10△*#

2.6 腦組織中IGF-1R 蛋白表達(dá)

與對照組相比，模型組和模擬物組中IGF-1R蛋白表達(dá)明顯降低，且模擬物組中IGF-1R 蛋白表達(dá)低于模型組（P<0.05）；與模型組相比，抑制物組中IGF-1R 蛋白表達(dá)顯著增加（P<0.05）（圖3）。

圖3 大鼠組織IGF-1R 蛋白表達(dá)情況

2.7 神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況

流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率從高到低依次為模擬物組、模型組、抑制物組、對照組組，4 組神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（圖4）。

圖4 大鼠神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況

3 討論

缺血性腦血管疾病多因血流突然停止或減少引起，或由于溶栓后，缺血區(qū)血流量正常卻呈現(xiàn)更加嚴(yán)重的腦損傷即腦I/R，其發(fā)病機制較為復(fù)雜，涉及致病因素較廣，給臨床治療帶來阻礙[10]。近年來，miR-122 在臨床研究、實踐中得到更多關(guān)注，特別是在對I/R 功能恢復(fù)方面。IGF-1R 在腦內(nèi)表達(dá)十分豐富，如大腦皮層、海馬、下丘腦中均有表達(dá)，對乙酰膽堿產(chǎn)生有調(diào)控作用，可以抑制神經(jīng)元凋亡，與認(rèn)知功能異常密切相關(guān)[11-12]。根據(jù)病因和目標(biāo)療法的研究基礎(chǔ)，miR-122 和IGF-1R 以及一些關(guān)聯(lián)因子慢慢地被用于I/R 的治療[13]。

本研究結(jié)果顯示，4 組腦梗死體積大到小為模擬物組、模型組、抑制物組、對照組。對照組腦組織結(jié)構(gòu)完整，神經(jīng)元排列緊密，無染色不勻現(xiàn)象。模型組腦組織神經(jīng)元排列呈疏松狀態(tài)，著色不勻，有大量空泡樣病理結(jié)構(gòu)改變。模擬物組腦組織結(jié)構(gòu)改變較模型組嚴(yán)重。抑制物組腦組織損傷病理變化逐漸減弱，神經(jīng)元排列較密，空泡樣病理改變減少。相關(guān)研究報道，miR-122 是I/R 發(fā)生的關(guān)鍵因素，在正常機體內(nèi)的變化具有規(guī)律性，而在I/R患者體內(nèi)會出現(xiàn)異常升高，因此，miR-122 對于維持機體血管功能和重要器官正常運轉(zhuǎn)具有重要作用[14]。本研究結(jié)果顯示，模型組和模擬物組小鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)增加，懸掛實驗評分顯著降低，干預(yù)后的抑制物組小鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)減少，懸掛實驗評分升高，提示miR-122 可改善缺血再灌注小鼠神經(jīng)功能。水迷宮實驗通過PT%和T%指標(biāo)評估小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力，兩者數(shù)值越大，說明小鼠的空間認(rèn)知記憶越好。本研究結(jié)果顯示，抑制物組小鼠PT%和T%值顯著高于模型組，提示miR-122 能增強腦I/R 小鼠認(rèn)知記憶能力，改善神經(jīng)行為學(xué)障礙。有研究證實，miR-122 可抑制2-Ag 代謝的突觸和認(rèn)知改善，參與了I/R 的病理生理機制，是誘發(fā)I/R 造成腦梗死的潛在生物學(xué)標(biāo)志[15]。miR-122 表達(dá)上升可抑制腦組織相關(guān)信號通路活性，如IGF-1R 通路等，對腦缺血后腦組織的修復(fù)產(chǎn)生抑制效果，神經(jīng)元呈現(xiàn)缺血狀態(tài)，患者腦出血病情加重，誘發(fā)I/R[16]，這與本研究結(jié)果相符。

本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組miR-122 水平呈顯著升高狀態(tài)，其余3 組miR-122水平從高到低依次為模擬物組、模型組、抑制物組。抑制物組IGF-1R 蛋白表達(dá)高于模型組、模擬物組；與對照組比較，模型組IGF-1R 蛋白表達(dá)明顯下降。神經(jīng)元細(xì)胞凋亡從高到低依次為模擬物組、模型組、抑制物組、對照組。相關(guān)文獻報道，IGF-1R 是一種異常活躍的信號通路，通過激酶反應(yīng)增加活性使其磷酸化，特定靶基因受到磷酸化影響，開始轉(zhuǎn)錄，并誘導(dǎo)相關(guān)蛋白表達(dá)，影響細(xì)胞增殖、分化和凋亡[17-18]。有研究報道，IGF-1R 信號通路與腦出血引起的腦水腫產(chǎn)生有關(guān)聯(lián)，增強IGF-1R 活性能效減少腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡，對體內(nèi)的炎癥反應(yīng)產(chǎn)生抑制效果，提高腦組織微循環(huán)及血流[19]。IGF-1R 活性增強可促進腦內(nèi)血管分支的建立及全身血液循環(huán)，腦缺血區(qū)神經(jīng)遞質(zhì)水平得到穩(wěn)定調(diào)節(jié)，神經(jīng)細(xì)胞凋亡被抑制，達(dá)到減緩疾病進程的目的[20]。

綜上所述，miR-122 低表達(dá)可減少腦缺血再灌注損傷小鼠腦梗死體積，增加IGF-1R 通路活性，對腦缺血再灌注損傷小鼠腦組織有一定的保護作用。