多巴胺對出血性腦卒中大鼠膠質纖維酸性蛋白和腦源性神經營養因子表達的影響及保護機制*

曹玉萍 王 倩 孟劍霞 程宏偉

（1 宿州市第一人民醫院神經內科 宿州 234000；2 上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院藥劑科，上海 200011；3 安徽醫科大學第一附屬醫院神經內科，合肥 230022）

腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是腦卒中的一種常見類型，具有較高的發病率、致殘率和死亡率[1-2]。腦出血發生后會引發腦水腫，神經系統功能障礙，以及細胞死亡和凋亡等繼發性的神經功能損傷[3-4]。腦出血會增加反應性星形膠質細胞，進而產生膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）。有研究表明GFAP 能通過抑制軸突再生，抑制神經干細胞（NSCs）的增殖和分化；還能減少谷氨酸鹽，讓腦組織重建時促進血管再生，進而對腦組織進行保護，恢復腦組織的神經功能[5]。腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）對中樞神經系統的發育有重要作用，可維持成年腦組織的正常功能[6]。多巴胺是一種內源性兒茶酚胺類神經遞質，在中樞神經系統中有重要的作用，因其具有調節運動的作用被廣泛認知[7]。有研究顯示，精神障礙疾病會導致多巴胺功能失調，介導神經退行性疾病[8-9]。研究顯示[10]，多巴胺和白介素等單克隆抗體可保護損傷后的腦組織，但其具體的作用機制尚不清楚。本研究對出血性腦卒中大鼠給予多巴胺進行干預治療，觀察其對出血性腦卒中大鼠腦組織中GFAP 和BDNF 的表達，并分析其對腦組織的保護機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

本實驗所有大鼠均來自北京化阜康生物科技股份有限公司，共計60 只健康大鼠，所有大鼠體質量均為（300±20）g，正常飼養大鼠，保證實驗室清潔，晝夜交換更替，保持實驗室溫度在24℃。

1.2 試劑和儀器

鹽酸多巴胺注射液（上海禾豐制藥有限公司）；GFAP 抗體（北京中杉生物試劑公司）；BDNF 抗體（武漢博士德生物工程有限公司）；TUNEL 染色液（Boehringer Mannheim 公司）。

1.3 動物分組與模型建立

將大鼠分為3 組，即假手術組（sham 組），大鼠腦出血模型組（ICH 組），大鼠腦出血模型給予多巴胺治療組（DA 組），每組20 只。本研究采用Fredrik[11]的方法制備大鼠腦出血模型，ICH 組和DA 組大鼠分別于右側腦組織基底核內注入大鼠新鮮的自體不凝血。腹腔麻醉大鼠后，取出大鼠右側股動脈血，以備顱內注射用。取動脈血后固定大鼠，將大鼠腦切開，暴露前鹵；將微量注射器的針端固定于前鹵前0.2 mm 處，以及中線右側旁開3 mm 處，在此處鉆出直徑為3 mm 的小孔。注射器從孔內進針6 mm，進針處約為大鼠基底核的位置；將大鼠自體的50 μL 的動脈血5 min 內完全注入，15 min后再將注射針慢慢拔出。將顱骨開的小孔用骨蠟進行封閉，把大鼠皮膚完全縫合后消毒。假手術組大鼠除不進行腦內自體血注射外，其他的步驟與ICH組和DA 組大鼠相同。大鼠腦出血模型標準：可見大鼠腦組織切片中有明顯的水腫，并且腦室內沒有血腫破入。

DA 組大鼠腹腔注射多巴胺溶液干預治療，20 mg/kg；假手術組和ICH 組大鼠均腹腔注射等量的生理鹽水干預，3 組大鼠均連續干預7 d。

1.4 標本采集

將大鼠麻醉，斷頭處死，取出腦組織，并分離腦組織中血腫的部位，放置于-20℃冰箱中冷藏備用。在制備模型過程中，沒有大鼠死亡，全部用于實驗。

1.5 神經功能障礙評分

給藥后48 h，按照Garcia[12]方法對3 組大鼠的神經功能障礙進行評分，其中自主活動、活動對稱性和前肢對稱性為0～3 分；觸摸觸須反應、金屬絲鼠籠攀援和觸摸雙側軀干反應為1～3 分。累計大鼠最后的得分，分數越低代表神經功能障礙越嚴重。

1.6 神經元形態比較[13]

神經功能測定后麻醉大鼠，并處死，將去除的腦組織固定于多聚甲醛溶液中，石蠟包埋并切成5 μm 的切片，尼氏染色觀察神經元形態，將切片放進入A 液中56℃染色60 min，PBS 漂洗，置于B 液分色數秒至2 min 直至背景色接近無色，自然晾干切片組織，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察尼氏小體數量。

1.7 腦水腫的測定

單獨一批大鼠用于腦水腫的測試。麻醉每組部分大鼠，PBS 溶液從左心室開始灌注，直至留出的液體呈透明時停止灌注。取出血腫周邊100 mg 的腦組織，并為腦組織進行稱量，稱其為濕質量（W）；將大鼠的腦組織放在烤箱中烘干處理，對烘干后的質量進行稱量，稱其為干質量（D）。對腦組織的含水量進行計算，（W-D）/W，最后再乘以百分之百。

1.8 腦組織病理學形態觀察

分別將3 組大鼠的腦組織取出，固定后進行石蠟包埋、切片，每個切片均為5 μm，切片脫蠟后行H-E 染色。觀察腦組織形態的變化。

1.9 TUNEL 染色檢測腦細胞凋亡

取出3 組大鼠腦組織，石蠟包埋后切片，切片脫蠟后加入蛋白酶K 工作液，放置孵育箱中進行孵育，孵育溫度為37℃，20 min 后將TUNEL 反應液加入，再孵育1 h，保證孵育環境全程避光，洗滌后將酶標記抗體加入其中，同等環境繼續孵育30 min，最后用DAB 顯色10 min，再用蘇木精進行復染，封片后在顯微鏡下選取5 個清晰的高倍視野進行觀察，計算細胞的凋亡率。

1.10 免疫組織化學顯色檢測GFAP 和BDNF 的表達

將3 組大鼠的腦組織用福爾馬林鈉溶液浸泡，石蠟包埋、切片、免疫組織化學顯色。陽性細胞為胞質清晰，且呈棕色顆粒狀；陰性細胞為無棕色染色顆粒。用圖像分析儀對陽性反應物和陽性細胞的百分數進行測定。其中A 為陽性細胞數量的分級[14]，0～1%=0+，>1%～10%=1+，>10%～50%=2+，>50%～80%=3+，>80%～100%=4+；陽性細胞顯色程度分級用B 表示，陰性為0，弱陽性為1，陽性為2，強陽性為3，最后對免疫組織化學顯色進行評分。陽性細胞數量的分級乘以陽性細胞顯示程度分級即為免疫組織化學評分。

1.11 統計學處理

采用SPSS 19.0統計學軟件進行分析，計量資料用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 神經功能評分

與假手術組（17.12±0.52）大鼠相比較，ICH組（8.94±2.36）大鼠的神經功能障礙評分顯著減少（P<0.05）；與ICH 組相比，DA 組（11.96±0.15）大鼠的神經功能障礙評分顯著增加（P<0.05）。

2.2 大鼠神經元形態比較

與假手術組尼氏小體數量（124.5 個±10.3 個）比較，ICH 組尼氏小體數量（35.1 個±5.6 個）顯著減少（P<0.05）；與ICH 組相比，DA 組尼氏小體數量（82.7 個±7.8 個）明顯增加（P<0.05）（圖1，見封二）。

圖1 大鼠神經元形態比較（尼氏染色，標尺=50 μm）。

2.3 大鼠腦水腫情況比較

與假手術組（77.82%±1.32%）大鼠相比，ICH 組（85.91%±1.82%）大鼠腦組織含水量明顯增加（P<0.05）；與ICH 組相比，DA 組（78.56%±1.33%）大鼠腦組織含水量明顯減少（P<0.05），表明多巴胺可有效改善大鼠腦水腫情況。

2.4 大鼠腦組織形態變化比較

與正常的腦組織形態相比，ICH 組大鼠的腦組織出現了不同程度的水腫，其中一部分神經細胞出現了明顯的腫脹，間質之間明顯增寬，神經元結構受到了嚴重的破壞，嚴重的神經元出現壞死，且有大量的炎性細胞浸潤；干預后的DA 組大鼠的腦組織形態得到了明顯的改善（圖2，見封二）。

圖2 大鼠腦組織H-E染色圖，標尺=50 μm。

2.5 腦細胞凋亡情況比較

結果顯示，假手術組大鼠無凋亡細胞。ICH組腦細胞凋亡率顯著多于假手術組（P<0.05）；與ICH 組大鼠相比，DA 組腦細胞凋亡率顯著減少（P<0.05）（圖3，見封二）。

圖3 大鼠腦組織TUNEL染色圖，標尺=50 μm。

2.6 大鼠腦組織中GFAP 和BDNF 蛋白表達比較

與假手術組大鼠相比較，ICH 組大鼠腦組織中GFAP 陽性表達增加，BDNF 蛋白陽性表達顯著降低（P<0.05）；與ICH 組大鼠相比，DA 組大鼠腦組織中GFAP 陽性表達顯著降低，BDNF 蛋白陽性表達明顯增多（P<0.05）（圖4、5，見封二）。

圖4 大鼠腦組織中GFAP（A1～C1）和BDNF（A2～C2）蛋白免疫組織化學顯色，標尺=50 μm。

圖5 3 組大鼠腦組織中GFAP 和BDNF 蛋白表達比較

3 討論

腦出血通常是指原發性、且非外傷引起的腦實質內出血，占所有腦卒中的30%以上，其中有50%的患者在發病后1 個月內死亡，因此腦出血一直以來都備受臨床的廣泛關注[15]。目前對腦損傷后神經系統的有效保護，不僅可以減輕患者的腦出血癥狀，還能一定程度降低死亡率和致殘率[16]。當前在臨床上有多種神經保護劑，但治療的效果都不是非常滿意，多種因素綜合干預腦損傷的神經元損傷是其主要的一種原因，因此單純的依靠藥物治療很難取得理想療效。在中樞神經系統損傷后對調節性T 細胞活性混合物的研究中，一種或幾種可能傳輸一個早期信號給調節性T 細胞，疼痛相關的生理化合物在中樞神經系統損傷后被加強，其主要是讓調節性T 細胞的運輸大量減少，并且對調節性T 細胞的活性進行了抑制。多巴胺和P 物質等都在腦組織和免疫系統中有一定的作用，并且彼此之間能相互作用[17]。但通過實驗研究顯示，T 細胞的生物活性只有多巴胺能進行有效降低，并且多巴胺多是通過ERK 依賴途徑完成[18]。多巴胺能對物質的活性進行抑制。顧新霞等[18]在對小鼠的實驗研究中，讓小鼠的中樞神經系統發生一定的機械性和化學性的損傷，用多巴胺或D1 受體刺激劑給予小鼠干預治療，由此發現神經系統受到一定的保護，其可能是通過抑制調節性T 細胞的活性來完成的。本實驗通過對腦出血大鼠模型給予多巴胺進行干預治療，觀察多巴胺對腦出血損傷的作用，以及探討其對腦組織中GFAP 和BDNF 蛋白的影響。

腦出血患者中最為常見的并發癥之一是神經功能障礙，在臨床上主要表現為反應遲鈍和記憶力下降等[19-20]。本研究結果顯示，腦出血大鼠模型的神經功能障礙明顯加重，且神經細胞的活性明顯降低；經過多巴胺干預治療后大鼠的神經功能和細胞的活性均得到了顯著改善。對比3 組大鼠的腦水腫情況顯示，腦出血大鼠的水腫情況明顯加重，多巴胺治療后大鼠的腦水腫情況得到了顯著的改善，可見多巴胺可一定程度的減輕大鼠的神經功能障礙，同時讓腦水腫得到明顯改善。賈志英等[21]通過實驗研究證實，對于輕度及中度腦缺血缺氧的新生兒，在早期給予多巴胺聯合納洛酮進行干預治療，新生兒領域評分均得到了顯著提高，同時改善患兒神經行為發育情況。在腦出血發生后，腦組織會出現大量細胞凋亡甚至死亡。本研究結果顯示，腦出血大鼠腦組織中可見大量的凋亡細胞，給予多巴胺治療后大鼠腦組織細胞凋亡明顯減少，并且該組大鼠的腦組織形態也得到了明顯改善。俞茹云等[22]通過動物實驗研究顯示，多巴胺可有效減少炎癥小體的活性，其可能是通過CART 進行，從而保護缺血性腦卒中大鼠的腦組織。

在腦組織中，GFAP 是一種較為特殊的中間絲蛋白，也是星形膠質細胞特異性的主要標志物，作為細胞骨架的GFAP 可有效對抗細胞損傷。本研究結果顯示，GFAP 在腦出血大鼠腦組織中表達升高，可見腦出血大鼠腦組織中GFAP 呈高表達。在成熟的神經系統內，神經元的正常功能和活性均需BDNF 進行維持，BNDF 可為損傷的神經元提供必要的營養，同時還能讓中樞神經損傷后的運動和感覺功能得到有效恢復。本研究結果顯示，ICH 組大鼠腦組織中BDNF 的表達顯著低于假手術組，DA組大鼠腦組織中的BDNF 表達得到了顯著提高。袁宇等[23]研究表明，多巴胺能有效上調腦出血大鼠腦組織中GFAP 和BDNF 的表達，對神經癥狀的好轉有一定促進作用。劉宇明等[24]對腦出血患者研究顯示，患者血清中NSE、GFAP 和BDNF 的表達影響腦出血后患者的認知功能障礙，因此腦出血患者的認知功能障礙可用NSE、GFAP 和BDNF 的表達來進行判斷。

綜上，多巴胺能抑制腦組織中GFAP 表達，促進BDNF 表達，改善腦出血腦組織的神經功能障礙，進而對出血性腦卒中受損腦組織起到保護作用。