胃癌病理類型及分期與胃癌組織中PI3K/CREB表達水平的相關性分析*

張小輝 王海偉 孫 穎 王 靜 王云鵬

（1 邯鄲市中心醫院病理科，邯鄲 056001；2 河北醫科大學附屬醫院消化內科，石家莊 050017）

胃癌死亡率僅次于肺癌[1]，其發病率與患者年齡呈現正相關，男女患者人數比例約為2∶1[2]，該病患者年齡呈年輕化趨勢[3]。大多數患者確診胃癌時通常已屬進展期，治療方案較為復雜、難度升高，傳統的手術及放化療治療預后較差。研究顯示早期胃癌經有效診斷，并及時干預治療，患者存活率可提高至90%以上，而晚期胃癌患者的術后存活率不超過30%。因此尋找簡單、有效的早期胃癌篩選方法非常重要。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）是細胞轉導的磷酸化酶，能夠在細胞的轉錄、翻譯和代謝以及腫瘤發生過程中發揮關鍵作用[5]。cAMP 反應序列結合蛋 白（cAMP responsive element binding protein，CREB）通過蛋白激酶磷酸化激活后可持續刺激重要目標基因表達，在腫瘤的發生發展中有重要作用[6]。在胃癌進程中均檢測到PI3K、CREB 異常表達，提示其可能參與了胃癌細胞的發生進程[7]。本研究重點探討胃癌病理類型及分期與胃癌組織中PI3K/CREB 表達水平的相關性。

1 材料和方法

1.1 一般資料

選取2017年6月～2019年6月于本院治療的140 例手術治療的胃癌患者，取患者胃癌組織以及癌旁1 cm 處組織石蠟包埋，存于-80℃液氮。患者中位年齡52.3 歲±4.9 歲，其中男性患者76 例、女性患者64 例。

1.2 納入標準

①符合胃癌診斷標準；②首次胃癌根治術治療患者；③均存在明確TNM 分期及組織學分級的患者；④患者知情，且無條件配合此項目研究。

1.3 排除標準

①經過放化療冶療的患者；②患者資料不完整；③合并其他惡性腫瘤或重要器官衰竭。

1.4 試劑

兔抗人多克隆抗體及單克隆抗體（美國Abcom 公司）；DNA 裂解液（武漢碧云天Co.Ltd）；以及PBS 緩沖液（南京金益柏Co.Ltd）；DAB 顯色劑（北京金克隆Co.Ltd）；免疫組織化學SP 試劑盒（武漢艾迪抗Co.Ltd）等。

1.5 免疫組織化學檢測陽性細胞

1.5.1 免疫組織化學檢測 取樣本脫蠟水化，H2O2失活，低火加熱1 min 修復抗原，加血清封閉，然后加一抗，PBS 沖洗，再加入二抗，最后加入DAB 顯色劑染色，PBS 清洗，全程按照說明書操作，顯微鏡隨機選5 個視野觀察結果。

1.5.2 染色結果判斷 胃癌組織中的陽性信號為淡黃色至棕褐色，CREB 陽性位于細胞核，PI3K 陽性定位于細胞質。

1.5.3 4 級記分評價方法 具體評價方法見表1。

表1 記分標準

1.6 免疫印跡檢測蛋白表達

取胃癌組織50 mg 加入裂解提取蛋白，分裝后于-20℃凍存，提取組織中總蛋白測定濃度，100 V SDS-PAGE 對總蛋白進行電泳，然后將蛋白樣品轉移到PVDF 膜上，加脫脂奶粉封閉1 h。加入一抗后TTBS 漂洗，間隔10 min，一共3 次漂洗，最后加入二抗，常溫環境中封閉1 h，取出PVDF 膜TTBS 漂洗3 次，每次10 min，GAPDH 作內參，DAB 顯色后照相。

1.7 統計學處理

采用SPSS 23.0 軟件對檢測結果進行分析，PI3K、CREB 蛋白表達采用n（%）或±s（符合正態分布）表示，行χ2或t檢驗進行比較，生存率比較采用log-rank 檢驗，GraphPad Prism 7 繪制受試者工作特征曲線（ROC 曲線），以P<0.05 判斷為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PI3K/CREB 在胃癌組織、癌旁組織陽性表達率

免疫組織化學法檢測結果顯示，PI3K 在胃癌細胞胞質中呈顆粒狀陽性表達，分布不均勻，CREB 在胃癌細胞核中呈現陽性棕黃色顆粒表達。PI3K 在胃癌組織中的陽性率是68.57%，在癌旁組織中陽性率為35.71%，兩者對比，前者陽性率較高（P<0.05）；CREB 在胃癌組織中陽性表達率（72.86%）較癌旁組織（40.00%）明顯升高（P<0.05）（表2，圖1）。

圖1 免疫組織化學法檢測PI3K（A1、B1）/CREB（A2、B2）表達情況，標尺=50 μm

表2 PI3K/CREB 在胃癌組織、癌旁組織中表達情況對比[n/（%）]

2.2 PI3K/CREB 在胃癌組織、癌旁組織蛋白表達量

免疫印跡檢測結果顯示，胃癌組織中PI3K/CREB的蛋白表達量均高于癌旁組織（P<0.05）（圖2）。

圖2 胃癌組織、癌旁組織中 PI3K/CREB 蛋白表達

2.3 PI3K/CREB 陽性表達與臨床病理類型及分期的相關性

胃癌組織中PI3K、CREB 在低分化（81.72%，86.02%）、Ⅲ+Ⅳ期（79.05%，82.86%）中陽性表達率均高于其在高中分化（42.55%，46.81%）、Ⅰ+Ⅱ期（37.14%，34.29%）的表達（P<0.05）；PI3K、CREB 在其他臨床特征中的陽性表達率比較差異均無統計學意義（P>0.05）（表3）。

表3 PI3K/CREB 陽性細胞數與臨床特征的相關性（n=140）

2.4 PI3K/CREB 蛋白相對表達量與臨床病理類型及分期的相關性

胃癌組織中PI3K、CREB 在低分化（0.934±0.029，0.729±0.059）、Ⅲ+Ⅳ期（0.732± 0.028，0.712±0.021）蛋白表達水平均高于高中分化（0.284±0.015，0.303±0.013）、Ⅰ+Ⅱ期（0.505±0.021，0.449±0.018）中的表達（P<0.05），在其他臨床特征中的PI3K、CREB 蛋白表達比較差異無統計學意義（P>0.05）（表4）。

表4 PI3K/CREB 蛋白表達量與臨床特征的相關性（n=140）

2.5 PI3K/CREB 表達與生存率的關系

96 例PI3K 陽性、106 例CREB 陽性表達患者5年內生存率（19.00%，20.00%）低于PI3K、CREB 陰性表達患者（26.00%，25.00%），組間比較差異有統計學意義（P<0.05）（圖3）。

圖3 PI3K/CREB 陰性、陽性患者的生存率比較

2.6 ROC 曲線分析

ROC 結果顯示，PI3K 診斷胃癌的ROC 曲線下面積（AUC）為0.765，靈敏度為78.64%、特異度為62.46%，CREB 診斷胃癌AUC 面積為0.774，靈敏度為70.93%、特異度為64.75%，說明檢測PI3K、CREB 水平對胃癌預后診斷具有重要意義（圖4）。

圖4 ROC 曲線分析

3 討論

胃癌是導致全球死亡率升高的主要原因，胃癌的發展也是多基因循序漸進由少到多的累積性疾病，其中大量癌癥基因表達異常，目前已經了解到多個致病因子在胃癌中活性升高，通過基因靶向干預的研究成為胃癌研究的熱點，但是當前胃癌的治療靶點及相關靶向藥物尚不能滿足臨床需求，許多胃癌亞型治療效果不佳[8-9]。因此，開發新的靶點對于胃癌的早期診斷及有效治療至關重要。

本研究通過免疫組織化學法和免疫印跡檢測樣本中的PI3K/CREB 表達，結果顯示PI3K/CREB在胃癌組織中的表達更高，同時結果還顯示PI3K、CREB 陽性表達的患者術后生存率低于陰性表達患者，說明PI3K/CREB 與胃癌預后具有相關性。PI3K 在多種生長因子、細胞因子刺激下會出現異常活化，激活下游底物蛋白激酶B，導致其磷酸化，誘導胃癌細胞生長、分化和侵襲[11-12]。周詩瓊等[13]研究表明PI3K 在胃癌組織中過度表達與胃癌的發展進程相關。同時其研究還表明胃癌細胞分化程度越低，PI3K 蛋白表達量越高，說明PI3K 表達可促進胃癌的惡性進展。PI3K 激活后可影響下游細胞凋亡調節因子、周期調控蛋白等靶分子，加快胃癌細胞分化，促使其轉換至合成DNA 期、有絲分裂期，抑制細胞凋亡，惡化病情。CREB 是一種能夠刺激基因轉錄的核內蛋白，在調節細胞分化、新陳代謝、控制細胞行為以及基因轉錄等方面扮演重要角色[14-15]。CREB 在非小細胞肺癌、膠質瘤、黑色素瘤等多種實體瘤中表達上調，且參與多種腫瘤的生物學行為如促進細胞增殖、抑制凋亡等。CREB通過轉錄調控其下游靶基因，參與腫瘤異常增殖、凋亡及侵襲等生物學行為。在胃癌中，CREB 高表達與淋巴結轉移、遠端轉移、腫瘤分期及患者不良預后有關，并提示CREB 可能為胃癌的獨立預后標志物[16-17]。

本研究結果顯示，在低分化、Ⅲ+Ⅳ期的腫瘤組織中PI3K/CREB 的表達更高，說明PI3K/CREB 表達隨病情的進展增強，與胃癌的惡性進展有關。ROC 曲線結果顯示，PI3K 診斷胃癌AUC 面積為0.765，靈敏度為78.64%、特異度為62.46%，CREB 診斷胃癌AUC 面積為0.774，靈敏度為70.93%、特異度為64.75%，說明檢測PI3K、CREB 對胃癌診斷存在意義。PI3K 在惡性腫瘤中屬于原癌基因，能夠隨著惡性腫瘤變異過程其表達升高。徐艷山等[18]研究顯示，CREB 在胃癌組織中呈陽性表達，與患者低分化及病理分期相關。CREB位于人染色體2q33.3，己經有多個研究報道其參與不同腫瘤類型的發生發展，通過下調CREB 能夠抑制胃癌生長、侵襲與血管生成。PI3K 細胞信號轉導通路參與胃癌的發生、發展、浸潤轉移，可以作為胃癌預后的獨立指標[19]。Liu 等[20]報道，PI3K與胃癌侵襲、轉移密切相關，PI3K 與Akt 可能存在協同作用，共同促進胃癌的惡性進展。

綜上所述，PI3K、CREB 在胃癌組織中呈現高表達，且與胃癌疾病進展存在相關性，對胃癌預后診斷具有重要意義。