紅景天苷對煙霧暴露大鼠肺微血管內皮細胞活性及細胞核因子-κB/Bcl-2表達水平的影響*

黃 會 曾玉蘭 廖珍慧 施玉琴 黃 露 周月泉

（華中科技大學同濟醫學院附屬梨園醫院，武漢 430077）

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是呼吸系統的常見病、多發病，40歲以上人群COPD的患病率達到13.7%[1]，在吸煙人群中也有約24%患有此病[2]。研究證實，香煙煙霧可以導致機體肺組織產生炎癥反應[3]。煙霧暴露可通過炎癥反應、氧化應激、血管活性物質調節細胞內免疫應答通路引起肺血管平滑肌細胞增殖，導致管壁增厚，管腔狹窄，血管管腔纖維化或完全閉塞[4]。肺微血管內皮細胞（pulmonary microvascular endothelial cell，PMVEC）在肺損傷過程中較為活躍，介導疾病發生發展。生理條件下，它們依靠其正常的增殖和凋亡平衡維持著細胞數量的穩定和血管功能正常[5]。研究表明，細胞抗凋亡因子B 淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）和細胞核因子-κB（nuclear factor-κB，NFκB）在PMVEC 中均有表達，可能介導COPD[6]。紅景天苷是中草藥紅景天的一種提取物[7]，具有較強的抗氧化、抗炎、抗凋亡、抗衰老、抗COPD 及抗缺氧等特性[8-9]。然而紅景天苷能否調節煙霧暴露大鼠PMVEC 活性及對PMVEC 的調控作用機制尚不清楚。因此本研究探究紅景天苷對煙霧暴露大鼠PMVEC 活性及NF-κB/Bcl-2 表達水平的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和試劑

選擇50 只健康成年SD 大鼠，CV 級，雌雄不限，體質量250～350 g，均由鄭州大學實驗動物中心提供，常溫飼養。

散花牌過濾嘴香煙由河南中煙工業有限公司生產，每支焦油含量為13 mg，尼古丁含量為1.0 mg，CO 含量為14 mg；紅景天苷由上海源葉生物科技有限公司生產；多聚甲醛購自上海蕓強化工有限公司；Bcl-2 兔抗、NF-κB 兔抗和DAB 顯色試劑盒均購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.2 動物分組與模型建立

50 只大鼠隨機分為空白組，煙霧組，紅景天苷低、中、高劑量組。制備大鼠被動吸煙裝置，煙熏箱大小為115 cm×65 cm×50 cm，每側各留9 個直徑2.5 cm 的通氣孔。被動吸煙實驗中，10 支香煙捆扎為一組后點燃，并置于煙熏箱中的支架上。用測氧儀對煙熏箱中氧氣的濃度進行監測，根據測得的結果對箱中的通氣孔數量進行適當調節，使箱中氧氣濃度盡量保持在20%。所有大鼠每天吸煙2次，每次吸煙間隔4 h，制備COPD 大鼠模型?？瞻捉M大鼠不做任何處理，常規飼養；煙霧組大鼠分別置于煙熏箱內，在4 周內每天吸煙2 次，每次吸煙10 支，每次30 min，中間間隔4 h；紅景天苷低、中、高劑量組大鼠在煙霧吸入基礎上分別給予50、100 mg/kg 和200 mg/kg 的紅景天苷，均腹腔注射；空白組和煙霧組大鼠同期給予同等容積的滅菌注射用生理鹽水經腹腔注射。所有大鼠共干預16 周，每周干預6 d，每天1 次。

1.3 標本采集

麻醉所有大鼠后處死，打開大鼠的胸腔，把大鼠的右主支氣管進行結扎，將右肺快速取出，分離出右肺動脈，將取出的右肺保存在-80℃備用。左肺用4%多聚甲醛經氣管充分灌注直至胸膜平整，結扎左主支氣管后剪下，放入4%的中性甲醛固定液中，用于H-E 染色。

1.4 肺組織H-E 染色及病理學觀察

給藥結束后第3 天打開大鼠胸腔，夾閉右主支氣管，經氣管插管處以25 cm 汞柱的灌注壓力向左主支氣管內灌注4%多聚甲醛，近心端縫線結扎離斷肺后浸于4%多聚甲醛48 h，之后梯度脫水、二甲苯透明，石蠟包埋。以5 μm 厚度切片，脫蠟，梯度水化，后行H-E 染色，二甲苯透明后中性樹膠封片。高倍顯微鏡下用軟件測量平均肺泡間隔、平均肺泡數，評估造模是否成功。

1.5 免疫印跡檢測NF-κB 和Bcl-2 蛋白表達

分別提取4 組大鼠肺組織100 mg，將組織裂解，提取蛋白，測量蛋白濃度，分裝后保存在-20℃冰箱。將蛋白溶液與緩沖溶液按4∶1 比例混勻，后煮沸、變性。在電泳板內分別注入50 μmol/L 的蛋白樣品，把電泳后的樣品轉移至PVDF 膜上，加入脫脂奶粉封閉1 h。加入一抗后TTBS 漂洗10 min×3 次，加入二抗常溫1 h。取出PVDF 膜，TTBS 漂洗10 min×3 次，DAB 顯色后數碼相機照相。

1.6 PMVEC 原代培養和鑒定

1.6.1 PMVEC 原代培養 麻醉大鼠，消毒后分離大鼠皮膚和肌肉組織，打開胸腔，暴露心肺，用夾子夾閉腔靜脈，放出血液后把肺循環灌洗干凈，再取出肺葉，放置在無血清培養基中培養。分離剔除臟層胸膜，剪下1 mm×1 mm×1 mm 大小的組織塊均勻貼在培養瓶中，培養瓶中留有適量的培養液，把培養瓶倒置在恒溫箱中進行孵育，4 h 后將瓶歸位，以確保培養液和組織塊恰好接觸。60 h 后觀察細胞從組織塊的游出情況，而后把組織塊移除，再加入培養液。當細胞融合達到80%～90%時，胰蛋白酶消化傳代。

1.6.2 PMVEC 鑒定 在顯微鏡下觀察細胞的形態改變，用相機進行拍照。取2 代細胞消化后用懸浮液接種于專用的蓋玻片上，培養48 h 后進行鑒定：多聚甲醛固定細胞后，加入CD34 多克隆抗體，4℃孵育過夜，DAPI 染色5 min，PBS 溶液終止染色；25 μg/mL BSI 加入到細胞中，避光1 h，抗熒光淬滅劑對細胞進行封片。

1.7 MTT 法檢測PMVEC 代謝活性

取對數期生長的PMVEC，用胰酶消化成細胞懸液，將其種植于96 孔板中，置于培養箱內培養5 h 后，棄去培養液，PBS 清洗3 遍，換內皮細胞培養基（endothelial cell medium，ECM）繼續培養24 h，觀察細胞生長狀態良好，再換條件培養液培養24 h。根據實驗要求將PMVEC 分別培養24 h及48 h。于實驗終止4 h 前避光條件下加入濃度為5 mg/mL 的MTT 溶液，每孔 20 μL，然后置入培養箱中孵育至實驗終止。取出細胞，吸去上清，每孔加入150 μL 的DMSO，溶解藍色結晶，待結晶溶解后上機檢測。

1.8 流式細胞儀檢測PMVEC 凋亡率

將PMVEC 用0.25%胰酶消化制成密度為1×105/mL 的細胞液，PBS 沖洗2 次，換用ECM 培 養24 h 后移至離心管中，加入400 μL 1×Binding Buffer 緩沖液、5 μL 的Annexin V-FITC輕輕混勻后避光孵育15 min，加入10 μL 的碘化丙啶（PI），輕輕混勻后冰浴5 min，在30 min 內上流式細胞儀檢測。

1.9 統計學處理

采用SPSS19.0 軟件進行分析。計量資料數據以±s表示，組間比較采用t檢驗，多組計量數據比較采用單因素分析法檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠肺組織病理形態

空白組大鼠支氣管、肺組織結構清晰、正常，可見完整的支氣管黏膜上皮和大小均勻的肺泡（圖1A）；煙霧組大鼠可見支氣管壁和肺泡結構被破壞，支氣管管腔結構變窄，可見炎癥細胞浸潤、黏性液分泌物，肺泡腔變大、壁薄；肺泡間隔變窄或中斷，還可見肺大泡（圖1B）；低、中、高劑量組的肺組織出現明顯改善，且紅景天苷高劑量組肺組織改善最為明顯（圖1C～1E）。

圖1 各組大鼠肺組織結構。

2.2 大鼠肺泡數和肺泡間隔

和空白組比較，煙霧組大鼠肺泡數顯著降低，肺泡間隔明顯升高（P<0.05）；和模型組比較，紅景天苷低、中、高劑量組大鼠肺泡數均顯著升高，肺泡間隔均顯著降低，其中高劑量組變化最為顯著（P<0.05）（表1）。

表1 各組大鼠肺泡數和肺泡間隔比較（n=10，±s）

表1 各組大鼠肺泡數和肺泡間隔比較（n=10，±s）

*P<0.05 vs 空白組；△P<0.05 vs 煙霧組；#P<0.05 vs 低劑量組；□P<0.05 vs 中劑量組

組別 肺泡數（個/mm2） 肺泡間隔（μm）空白組 534.7±100.1 36.7±6.2煙霧組 318.4±41.2* 55.2±10.1*低劑量組 421.6±63.7*△ 50.4±8.5*△中劑量組 468.9±75.3*△# 46.3±7.6*△#高劑量組 500.4±83.6*△#□ 39.8±6.9*△#□

2.3 大鼠NF-κB 和Bcl-2 蛋白表達

和空白組比較，煙霧組大鼠肺組織NF-κB 蛋白表達顯著升高，Bcl-2 蛋白表達明顯降低（P<0.01）；和煙霧組比較，紅景天苷低劑量組和高劑量組肺組織NF-κB 蛋白表達顯著降低，Bcl-2 蛋白表達顯著升高，且紅景天苷高劑量組的變化最為顯著（P<0.01）（圖2）。

圖2 各組大鼠NF-κB 和Bcl-2 蛋白表達比較。

2.4 大鼠原代PMVEC 的生長情況

60 h 后，可觀察到細胞從肺組織塊的邊緣游出（圖3A）；5～7 d 后可見細胞長成單層，呈鋪路石樣排列，形態為多角形或短梭型，且細胞大小均勻（圖3B）。

2.5 PMVEC 免疫細胞化學鑒定

熒光顯微鏡下觀察到PMVEC 細胞質內綠色熒光顆粒，CD34 陽性表達，證實培養的細胞為血管內皮細胞。與FITC 標記的植物凝集素BSI 的陽性結合，證實該細胞為微血管內皮細胞（圖3C）。

圖3 組織貼塊法培養大鼠PMVEC。

2.6 大鼠PMVEC 活性

和空白組比較，煙霧組大鼠24 h 和48 h 的PMVEC 活性明顯降低（P<0.01）；和煙霧組比較，紅景天苷低、中、高劑量組大鼠的PMVEC 活性顯著提升（P<0.01），且高劑量組大鼠PMVEC 活性明顯高于低劑量組和中劑量組（P<0.05）（表2）。

表2 各組大鼠PMVEC 活性比較（n=10，±s）

表2 各組大鼠PMVEC 活性比較（n=10，±s）

*P<0.05 vs 空白組；△P<0.05 vs 煙霧組；#P<0.05 vs 紅景天苷低劑量組；□P<0.05 vs 紅景天苷中劑量組

組別 24 h 48 h空白組 1.01±0.11 1.52±0.22煙霧組 0.55±0.06* 0.37±0.05*紅景天苷低劑量組 0.77±0.17*△ 0.96±0.19*△紅景天苷中劑量組 0.83±0.18*△# 1.11±0.20*△#紅景天苷高劑量組 0.95±0.19*△□# 1.22±0.21*△□#

2.7 大鼠PMVEC 的凋亡率

和空白組比較，煙霧組PMVEC 凋亡率顯著增加（P<0.01），紅景天苷低、中、高劑量組PMVEC凋亡率顯著降低，且隨著紅景天苷劑量的增加，凋亡率降低更為顯著（P<0.01）（圖4、5）。

圖4 流式細胞儀檢測PMVEC 凋亡率散點圖。

圖5 大鼠PMVEC 細胞凋亡率比較

3 討論

既往研究證明，長期吸煙可導致COPD 的發生[10]。香煙煙草中所含有的化學成分極其復雜，煙草在燃燒的過程中釋放出煙霧，煙霧中的多種物質會導致炎癥和癌癥的發生，對機體的各個器官造成嚴重的損傷[11]。PMVEC 以緊密連接方式像地毯一樣覆蓋在肺血管腔表面，直接與血液接觸，是構成“氣血屏障”的基本結構，在生理和病理情況下都發揮著重要的作用[12]。PMVEC 及其緊密連接的蛋白對維持血管內壁完整性、調節血管通透性、防止凝血和血栓形成等起重要作用。PMVEC 的形態、功能和大血管起源的內皮細胞有很大不同，因此本研究體外培養煙霧暴露大鼠PMVEC，觀察紅景天苷對其細胞活性以及大鼠肺組織NF-κB 和Bcl-2 蛋白表達水平的影響。

煙霧所致肺氣腫模型類似于人的小葉中心型肺氣腫，這是香煙煙霧相關性 COPD 最常見的病理類型。本研究用不同劑量的紅景天苷干預煙霧暴露大鼠，顯示干預后大鼠的肺組織病理學形態得到明顯改善。紅景天是景天科紅景天屬草本或亞灌木植物，主要生長在高海拔的喜馬拉雅山區、亞洲西部和北美洲等高寒地帶，具有頑強的生命力和耐低氧等特性，被譽為“高原人參”。《本草綱目》記載紅景天具有“去邪惡氣，補諸不足”的功效，大量研究證明紅景天苷具有保護神經元、肺組織等多種生物活性。張卓一等[13]研究顯示，紅景天苷可有效改善百草枯中毒大鼠的肺組織形態，其作用機制可能與調控Toll 樣受體4 和NF-κB 的表達有關。本研究結果與上述報道一致。

紅景天苷可以有效抗擊抑郁和焦慮，并且對衰老、疲勞和氧化等都有一定的拮抗作用[14-15]。本研究采用常用的組織貼塊法培養出大鼠PMVEC，實驗結果顯示紅景天苷能有效提高PMVEC 活性，同時抑制PMVEC 凋亡率。鄭明昱等[16]報道，模型組肺組織中轉化生長因子-β1（TGF-β1） mRNA 和蛋白表達水平與對照組相比顯著增高，而紅景天苷組肺組織中TGF-β1 mRNA 和蛋白表達顯著低于模型組，推測紅景天苷對平滑肌增殖、氣道上皮增生的抑制作用可能是通過下調TGF-β1 的表達而實現。康春燕等[17]研究表明，紅景天苷可抑制模擬微重力誘導的PMVEC 凋亡，其機制可能是影響了PI3K/Akt 通路。Bcl-2 家族在細胞內的凋亡信號轉導過程中起重要的作用，是重要的抗凋亡分子[18]。NF-κB 是Rel 蛋白家族的成員之一，廣泛存在于各種細胞中，為重要的轉錄調控因子，與免疫應答，細胞增殖、生長及分化，細胞存活及凋亡均有密切關系[19]。有研究證實吸煙可以使肺組織NF-κB 的表達增強，本實驗結果也顯示煙霧組大鼠肺組織NF-κB 表達顯著增加，Bcl-2 的表達明顯降低；干預后的紅景天苷低劑量和高劑量組大鼠NF-κB 表達均得到了顯著抑制，明顯增加了Bcl-2 的表達，但紅景天苷高劑量組的蛋白表達改善最為明顯。Recio 等[20]研究表明，紅景天苷能夠改善COPD 可能 與MAPK/NF-κB 通路相關。Chen 等[21]研究證實，紅景天苷通過激活Nrf2 抗氧化信號通路及抑制NF-κB 和TGF-β1、Smad2/Smad3 通路發揮抗炎、抗氧化應激、抗纖維化效應。

綜上所述，紅景天苷可抑制煙霧暴露大鼠PMVEC 凋亡，其作用機制可能與抑制NF-κB 的活性、促進Bcl-2 表達有關。