木犀草素調控Nrf2/HO-1通路保護視網膜色素上皮細胞氧化損傷

洪 萌，洪道先，石榮先，魏 聰，趙曉麗，李權達

?KEYWORDS: luteolin; retinal pigment epithelium; oxidative damage; nuclear factor erythroid 2-related factor 2; heme oxygenase-1

0引言

年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration，ARMD)是一種累及黃斑部的不可逆退行性病變，是老年人視力損傷的主要病因之一[1]。隨著我國人口老齡化的進展，ARMD的發病人群逐年增多[2]。ARMD的具體病因及發病機制尚不明確，但越來越多的研究表明視網膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)細胞的氧化應激損傷與ARMD的發生、發展密切相關[3-4]。因此，保護RPE細胞免受氧化應激損傷是防治ARMD的重要途徑。已知E2相關因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)/血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)是機體內源性抗過氧化物的重要蛋白，被激活后可抑制過氧化物誘導細胞損傷[5]。因此調控Nrf2通路對于ARMD的防治具有潛在價值。木犀草素是一種天然的黃酮類化合物，廣泛存在于金銀花等多種藥用植物中，具有抗炎、抗氧化及抗病毒等多種藥理學作用[6]。目前研究表明木犀草素對RPE細胞及視網膜損傷具有保護作用[7-8]，但其是否能夠增強RPE細胞的抗氧化活性及其抗氧化機制尚不清楚。因此，本研究采用H2O2損傷RPE細胞建立體外氧化應激損傷模型，觀察木犀草素對RPE細胞氧化損傷的保護作用，并探討其作用機制。

1材料和方法

1.1材料人RPE細胞株ARPE-19(美國ATCC公司)；木犀草素(南京景竹生物科技有限公司)；DMEM/F12培養液、胎牛血清、胰蛋白酶(美國Gibco公司)；Nrf2抑制劑全反式維甲酸、四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)和H2O2等(美國Sigma公司)；丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒及酶聯免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒等(北京索萊寶科技有限公司)，Caspase-3單克隆抗體、多聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶(poly adeno-sine diphosphate ribose polymerase,PARP)單克隆抗體、B細胞淋巴瘤-2(B cell lymphoma-2,Bcl-2)單克隆抗體、Nrf2單克隆抗體、HO-1單克隆抗體及辣根過氧化物酶標記的IgG二抗(英國，Abcam)。主要儀器設備：臺式離心機(Thermo Fisher Micro21R，美國)，流式細胞儀(BD FACSCalibur，美國BD),酶標儀(HBS-1096C，南京德鐵實驗設備有限公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養ARPE-19細胞復蘇后接種于DMEM/F12培養基(含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100mg/mL鏈霉素)中，于37℃，5% CO2的培養箱中培養，待細胞生長融合至80%時，用0.25%胰蛋白酶進行消化并傳代，選取對數生長期的細胞進行后續實驗。

1.2.2分組及給藥將ARPE-19細胞分為對照組、H2O2組、不同劑量木犀草素組和Nrf2抑制劑組。對照組：不做任何處理；H2O2組：培養基中加入100μmol/L H2O2培養24h；不同劑量木犀草素組：培養基中分別加入25、50μmol/L木犀草素預處理2h后加入100μmol/L H2O2培養24h；Nrf2抑制劑組：培養基中加入木犀草素50μmol/L+10μg/mL全反式維甲酸預處理2h，然后加入100μmol/L H2O2培養24h。顯微鏡下觀察各組細胞形態變化。

1.2.3 MTT法檢測細胞活力取對數期生長的ARPE-19細胞，以1×105個/毫升接種于96孔板中，細胞貼壁后用不同濃度(0、25、50、100μmol/L)的木犀草素培養基培養或按照1.2.2的分組及給藥方式培養24h后，更換培養基，每孔加入20μL MTT(5mg/mL)，培養4h后棄培養基，每孔加入200μL二甲基亞砜(DMSO)溶液，震蕩10min后，采用酶標儀測定波長490nm處的光密度(A)值。細胞活力(%)=實驗組A值/對照組A值×100%。

1.2.4細胞凋亡的檢測取對數期生長的ARPE-19細胞，以1×106個/毫升接種于96孔板中，按照1.2.2的分組及給藥方式培養后，離心收集細胞。加入195μL結合液重懸細胞，然后加入5μL Annexin V-FITC混勻，室溫避光孵育10min；離心棄上清，加入190μL結合液重懸細胞，然后加入10μL PI染液混勻，4℃避光孵育10min。流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.5細胞內氧化應激水平的測定

1.2.5.1細胞內ROS水平測定取對數期生長的ARPE-19細胞，以1×106個/毫升接種于96孔板中，按照1.2.2的分組及給藥方式培養后，胰蛋白酶消化，PBS洗滌后加入熒光探針DCFH-DA，37℃避光孵育30min，使探針與細胞充分接觸，消化后離心收集細胞，用流式細胞儀(激發波長488nm，發射波長525nm)檢測細胞內的平均熒光強度，即ROS水平。

1.2.5.2細胞內MDA和SOD含量的測定收集各組細胞，超聲波破碎，離心取上清。采用硫代巴比妥酸比色法測定MDA含量，黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性，實驗步驟嚴格按照試劑盒說明方法進行。

1.2.6 Western blot檢測蛋白表達收集各組細胞，分別加入適量的蛋白裂解液(含PMSF)，冰上裂解30min，4℃離心15min，提取細胞總蛋白，并采用BCA法測定蛋白濃度。取40μg蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，將蛋白轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉過夜，分別加入Caspase-3、PARP、Bcl-2、Nrf2、HO-1、β-actin一抗(稀釋比例均為1∶1000)，4℃孵育過夜。加二抗(稀釋比例為1∶2000)，室溫孵育1h。電化學發光顯影后，采用Image J凝膠圖像分析系統計算目的條帶與內參條帶灰度值的比值，即目的蛋白的相對表達量。

表1 各組細胞ROS、MDA及SOD水平比較

2結果

2.1木犀草素對ARPE-19細胞活力的影響采用MTT法檢測木犀草素對ARPE-19細胞活力的影響，結果顯示，各組細胞活力差異有統計學意義(F=4.351,P=0.008)，見圖1。組間兩兩比較發現，100μmol/L木犀草素組細胞活力明顯低于對照組(P<0.05)，其余各組間差異無統計學意義(P>0.05)，說明100μmol/L木犀草素能抑制ARPE-19細胞活性。因此選擇25、50μmol/L木犀草素進行后續研究。

2.2木犀草素對H2O2誘導的ARPE-19細胞活力的影響各組細胞增殖活力比較差異有統計學意義(F=217.539,P<0.01)，見圖2。組間兩兩比較發現，H2O2組細胞活力明顯低于對照組(P<0.05)；25μmol/L和50μmol/L木犀草素組細胞活力明顯高于H2O2組(P<0.05)，且50μmol/L木犀草素組變化更明顯(P<0.05)；而Nrf2抑制劑組細胞活力明顯低于50μmol/L木犀草素組(P<0.05)。

2.3木犀草素對H2O2誘導的ARPE-19細胞形態學的影響對照組ARPE-19細胞呈梭形貼壁生長，細胞輪廓清晰；H2O2組細胞皺縮、變小、變圓，失去正常形態，部分細胞不能貼壁生長；25μmol/L和50μmol/L木犀草素組細胞形態得到改善，50μmol/L木犀草素組較25μmol/L組更為明顯。Nrf2抑制劑組部分細胞形態異常，與25μmol/L木犀草素組細胞類似(圖3)。

2.4木犀草素對H2O2誘導的ARPE-19細胞凋亡的影響流式細胞儀檢測結果見圖4A，各組細胞調亡率比較，差異有統計學意義(F=139.473,P<0.01)。組間兩兩比較發現，H2O2組細胞凋亡率明顯高于對照組(P<0.05)；25μmol/L和50μmol/L木犀草素組細胞凋亡率明顯低于H2O2組(P<0.05)，且50μmol/L木犀草素組變化更明顯(P<0.05)；而Nrf2抑制劑組細胞凋亡率明顯高于50μmol/L木犀草素組(P<0.05)。

Western blot分析結果見圖4B，各組細胞Caspase-3、PARP及Bcl-2蛋白表達水平比較，差異均有統計學意義(F=217.776、172.167、190.00,均P<0.01)。組間兩兩比較發現，H2O2組細胞Caspase-3和PARP的蛋白表達水平明顯高于對照組(P<0.05)，Bcl-2水平明顯低于對照組(P<0.05)；25μmol/L和50μmol/L木犀草素組細胞Caspase-3和PARP的蛋白表達水平明顯低于H2O2組(P<0.05)，Bcl-2水平明顯高于H2O2組(P<0.05)，且50μmol/L木犀草素組變化更明顯(P<0.05)；Nrf2抑制劑組細胞Caspase-3和PARP的蛋白表達水平明顯高于50μmol/L木犀草素組(P<0.05)，Bcl-2水平明顯低于50μmol/L木犀草素組(P<0.05)。

圖1 木犀草素對ARPE-19細胞活力的影響 aP<0.05 vs 對照組。

圖2 木犀草素對H2O2誘導的ARPE-19細胞活力的影響

2.5木犀草素對H2O2誘導的ARPE-19細胞氧化應激水平的影響各組細胞ROS、MDA和SOD水平比較，差異均有統計學意義(F=150.065、192.916、98.318,均P<0.01)，見表1。組間兩兩比較發現，H2O2組細胞ROS和MDA含量明顯高于對照組，SOD活性明顯低于對照組(P<0.05)；25μmol/L和50μmol/L木犀草素組細胞ROS和MDA含量明顯低于H2O2組，SOD活性明顯高于H2O2組，且50μmol/L木犀草素組變化更明顯(P<0.05)；Nrf2抑制劑組細胞ROS和MDA含量明顯高于50μmol/L木犀草素組(P<0.05)，SOD活性明顯低于50μmol/L木犀草素組(P<0.05)。

圖3 木犀草素對H2O2誘導的ARPE-19細胞形態學的影響(×100) A：對照組；B：H2O2組；C：25μmol/L木犀草素組；D：50μmol/L木犀草素組；E：Nrf2抑制劑組。

圖4 木犀草素對H2O2誘導的ARPE-19細胞凋亡的影響 A：流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況；B：各組細胞Caspase-3、PARP及Bcl-2蛋白水平比較。aP<0.05 vs對照組；cP<0.05 vs H2O2組；eP<0.05 vs 50μmol/L木犀草素組。

圖5 各組細胞Nrf2和HO-1蛋白表達水平比較 aP<0.05 vs對照組；cP<0.05 vs H2O2組；eP<0.05 vs 50μmol/L木犀草素組。

2.6木犀草素對H2O2誘導的ARPE-19細胞Nrf2和HO-1蛋白表達的影響Western blot分析顯示，各組細胞Nrf2和HO-1蛋白表達水平比較，差異有統計學意義(F=121.475、117.352,均P<0.01)，見圖5。組間兩兩比較發現，H2O2組細胞Nrf2和HO-1蛋白表達水平明顯低于對照組(P<0.05)；25μmol/L和50μmol/L木犀草素組細胞Nrf2和HO-1蛋白表達水平明顯高于H2O2組(P<0.05)，且50μmol/L木犀草素組變化更明顯(P<0.05)；Nrf2抑制劑組細胞Nrf2和HO-1蛋白表達水平明顯低于50μmol/L木犀草素組(P<0.05)。

3討論

ARMD是盲的主要原因，隨著人類壽命的延長，其發病率逐年提高。當前研究發現長期氧化應激導致的RPE細胞結構與功能異常是引發ARMD的重要原因之一[9-10]。目前，通過抗氧化劑治療ARMD已成為研究熱點。木犀草素是一種天然黃酮類化合物，具有抗氧化、清除氧自由基等生物學活性[11-12]。本研究利用100μmol/L H2O2建立RPE細胞氧化損傷模型，觀察木犀草素對ARPE-19細胞的保護作用及其可能的機制。本研究使用MTT法檢測ARPE-19細胞活性，結果發現給予H2O2處理時細胞活力顯著下降；而給予不同劑量木犀草素預處理后給予H2O2誘導，細胞活力明顯升高，其中50μmol/L木犀草素預處理的細胞活性最高，表明木犀草素對H2O2誘導的ARPE-19細胞損傷具有保護作用。同時Hytti等[7]研究發現木犀草素對氧化應激損傷后的RPE細胞具有保護和修復作用；魏達亨等[8]研究發現木犀草素通過降低HMGB1表達減輕NF-κB介導的炎癥，抑制碘酸鈉誘導的RPE細胞凋亡，保護視網膜免受損傷。說明木犀草素對多種因素引起的視網膜損傷均具有一定的保護作用。此外，本研究還發現各劑量木犀草素能降低ROS和MDA含量，增強SOD活性，表明木犀草素可以清除H2O2誘導生成的ROS，促進RPE細胞內抗氧化物質含量增加，提高RPE細胞抗氧化應激能力，在一定程度上逆轉H2O2引起的細胞氧化應激損傷，進一步說明木犀草素對視網膜氧化損傷具有保護作用。同時肖童等[13]研究發現木犀草素預處理對H2O2誘導的大鼠心肌H9C2細胞氧化應激損傷具有保護作用。提示木犀草素對H2O2誘導的細胞損傷具有一定的保護作用。

研究顯示RPE細胞功能受損時可以引起細胞凋亡，而木犀草素具有顯著的抗凋亡特性[14-15]。我們使用流式細胞術檢測發現，H2O2處理后ARPE-19細胞凋亡率明顯升高，而給予木犀草素處理后細胞凋亡率明顯降低，且Caspase-3和PARP蛋白表達水平明顯降低，Bcl-2水平明顯升高，提示木犀草素能夠抑制H2O2誘導的細胞凋亡。同時魏達亨等[8]研究發現，木犀草素可以抑制碘酸鈉誘導的ARPE-19細胞凋亡。提示木犀草素能對RPE細胞功能受損引起的細胞凋亡具有一定抑制作用。

Nrf2通路作為重要的內源性抗氧化應激通路，在氧化應激反應應答中起關鍵作用[16]。Nrf2是調節氧化還原平衡的關鍵轉錄因子[17]。靜息狀態下，Nrf2在細胞漿中與Keap1結合，經泛素化-蛋白酶體降解[18]。氧化應激狀態下，氧化還原平衡被打破，Nrf2被活化，從Keap1中釋放并轉移至細胞核，與核內的抗氧化反應元件(ARE)結合，上調下游Ⅱ相解毒酶和抗氧化基因的表達，提高抗氧化酶GSH-Px和SOD的活性，從而實現抗氧化應激作用[19-20]。HO-1作為Nrf2調控的下游蛋白，可以催化血紅素降解生成膽綠素、一氧化碳和游離鐵，四者共同形成細胞抗氧化應激損傷的內源性保護系統，減弱氧化應激及炎性反應，同時抑制促凋亡蛋白的表達，抑制細胞凋亡[21-22]。本研究結果發現，木犀草素能上調H2O2誘導的ARPE-19細胞中Nrf2及HO-1蛋白的表達，而加入Nrf2抑制劑后，Nrf2和HO-1蛋白表達明顯降低，說明木犀草素能夠通過某種方式激活Nrf2，從而上調下游抗氧化基因HO-1蛋白的表達，增強細胞清除ROS的能力，維持細胞內氧化還原狀態的平衡，抑制氧化應激反應，保護細胞免受氧化應激損傷，而Nrf2抑制劑能逆轉木犀草素對H2O2誘導的細胞氧化應激損傷保護作用，進一步說明了木犀草素可通過激活Nrf2來抑制H2O2誘導的氧化應激損傷。已有研究發現木犀草素可以激活人臍靜脈內皮EA.hy926細胞Nrf2信號通路，抑制H2O2誘導的細胞毒性，對細胞具有氧化損傷保護作用[23]。提示木犀草素可通過Nrf2來發揮抗氧化作用。

綜上所述，木犀草素對H2O2誘導的ARPE-19細胞氧化應激損傷具有保護作用，其機制可能與激活Nrf2/HO-1信號通路，抑制氧化應激反應有關，為臨床治療ARMD提供了新策略。