唾液lnc-JAKMIP2-1∶1對早期肝細(xì)胞癌的診斷價(jià)值

謝子鈞?雷一鳴?劉慧玲?江潔

【摘要】目的 探討唾液中可作為協(xié)診早期肝細(xì)胞癌的lncRNA標(biāo)志物。方法 首先利用Agilent基因芯片技術(shù)，在3份正常肝組織和3份肝細(xì)胞癌組織中挑選表達(dá)差異最明顯的一種lncRNA。然后擴(kuò)大樣本量，利用定量PCR技術(shù)檢測這種lncRNA在肝細(xì)胞癌和對照正常組織、血漿和唾液中的表達(dá)水平。結(jié)果 lncRNA-JAKMIP2-1∶1在肝細(xì)胞癌患者的癌組織、血漿和唾液中均明顯升高（P均< 0.05），在肝細(xì)胞癌患者的癌組織、血漿和唾液中3種樣本中的表達(dá)顯示兩兩呈正相關(guān)，同時(shí)lnc-JAKMIP2-1∶1在早期（Ⅰ/Ⅱ期）肝細(xì)胞癌患者的唾液中表達(dá)就已經(jīng)明顯升高，在接受手術(shù)后，其表達(dá)又明顯下降。通過受試者工作特征曲線分析，唾液lnc-JAKMIP2-1∶1診斷早期肝細(xì)胞癌的靈敏度為100%，特異度為86%。結(jié)論 唾液lnc-JAKMIP2-1∶1是協(xié)診早期肝細(xì)胞癌的理想標(biāo)志物。

【關(guān)鍵詞】唾液;長鏈非編碼核糖核酸-JAKMIP2-1∶1;肝細(xì)胞癌;診斷;生物標(biāo)志物

Diagnostic performance of salivary lnc-JAKMIP2-1∶1 for early hepatocellular carcinoma Xie Zijun， Lei Yiming， Liu Huiling， Jiang Jie. Department of Gastroenterology， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， China

Corresponding author， Xie Zijun， E-mail： stephenxzj@qq.com

【Abstract】Objective This study was designed to explore lncRNA biomarkers in the saliva for detecting early hepatocellular carcinoma（HCC）. Methods The most aberrantly-expressed lncRNAs were identified by Agilent microarray in 3 normal liver tissues and 3 HCC tissues. The most aberrantly-expressed lncRNA was selected as a candidate biomarker. Subsequently， the expression level of the candidate lncRNA was measured by qPCR in the tissue， plasma and saliva of HCC patients and controls. Results The expression level of lncRNA-JAKMIP2-1∶1 was significantly up-regulated in the HCC tissue， plasma and saliva of HCC patients compared with that of controls. The expression levels of lnc-JAKMIP2-1∶1 were positively correlated in any two of these three samples. In addition， the expression level of lnc-JAKMIP2-1∶1 was significantly up-regulated in the saliva of patients with early HCC （stage Ⅰ/Ⅱ）， whereas it was significantly down-regulated after hepatectomy. According to the analysis of receiver operating characteristic curve， the diagnostic sensitivity of salivary lnc-JAKMIP2-1∶1 for early HCC was 100% and 86% for the specificity. Conclusion Salivary lnc-JAKMIP2-1∶1 shows great potential as a biomarker for detecting early HCC.

【Key words】Saliva; lnc-JAKMIP2-1∶1; Hepatocellular carcinoma; Diagnosis; Biomarker

據(jù)統(tǒng)計(jì)，90%以上的肝癌為肝細(xì)胞癌（以下簡稱肝癌）。就全球范圍而言，肝癌的致死率在男性中排第二，女性中排第六，5年總體生存率約在5%～9%。中國肝癌患者占全球新發(fā)和死亡病例的一半以上[1]。若早期肝癌（分期為Ⅰ/Ⅱ）患者接受根治性肝癌切除術(shù)，5年的總體生存率可達(dá)69%，但大約80%的肝癌患者在診斷時(shí)已屬晚期，失去了根治性手術(shù)的機(jī)會[2]。

多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，多種長鏈非編碼RNA（lncRNA，長度≥200 bp）在肝癌的癌組織和肝癌患者的血液中對肝癌展示出良好的診斷價(jià)值[3]。組織細(xì)胞通過壞死和凋亡將lncRNA釋放到血液循環(huán)中，由于人體的唾液腺有廣泛血供，唾液被認(rèn)為是血液循環(huán)的終產(chǎn)物。血液循環(huán)中的分子物質(zhì)可以通過唾液腺細(xì)胞重吸收然后釋放到唾液中，也可以通過唾液腺細(xì)胞中的間隙直接釋放到唾液中。所以唾液含有血液中的大部分分子物質(zhì)[4]。因此，唾液可能代替某些血液檢測協(xié)診各類疾病。本研究旨在從唾液中找出協(xié)診早期肝癌的lncRNA標(biāo)志物。

材料與方法

一、患者與樣本

樣本于2011年5月至2016年6月在中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院收集。本研究共選取3組研究對象：健康對照組、早期肝癌組、中晚期（Ⅲ/Ⅳ）肝癌組，每組各50例。癌癥分期按文獻(xiàn)[5]中美國癌癥聯(lián)合會癌癥分期第8版劃分。健康對照個(gè)體定義為常規(guī)體檢中X線胸片、口腔檢查、腹部超聲等無異常發(fā)現(xiàn);糞便潛血、血清甲胎蛋白、癌胚抗原、HBsAg、丙型肝炎病毒抗體、HIV抗體、梅毒抗體均為陰性或正常。肝癌患者在收集樣本前未接受過放射化學(xué)治療、生物治療或靶向治療。同時(shí)沒有并發(fā)如糖尿病、SLE、腎衰竭等器質(zhì)性疾病和其它癌癥。早期肝癌患者均接受了根治性肝癌切除術(shù)，癌癥分期按病理劃分。中晚期肝癌由腫物活組織檢查或CT/MRI確定。正常肝組織來源于肝血管瘤患者血管瘤旁5 cm以上的肝組織。正常肝組織、肝癌組織由2位專業(yè)的病理學(xué)醫(yī)師確定。

二、方 法

1.樣本的收集

手術(shù)切除組織離體后立即放入液氮，后置于-80℃冰箱保存。血漿的收集使用5 mL規(guī)格EDTA抗凝管，收集患者約3 mL靜脈全血后在4℃離心機(jī)使用3000×g離心10 min，收集上清后轉(zhuǎn)移至2 mL無酶EP管，后再在4℃中使用12 000×g離心10 min，最后再次收集上清轉(zhuǎn)移至新的EP管中，置于-80℃冰箱保存。在收集唾液前受檢個(gè)體須禁食、禁煙、禁止喝水2 h以上，后將唾液吐入20 mL規(guī)格無酶離心管。收集大概3 mL唾液，先在4℃離心機(jī)使用3000×g離心10 min，收集上清后轉(zhuǎn)移至2 mL無酶EP管，后再在4℃中使用

12 000×g離心10 min，最后再收集上清轉(zhuǎn)移至新的EP管中，置于-80℃冰箱保存。

2.候選標(biāo)志物的挑選

利用Agilent芯片高通量檢測并比較已發(fā)現(xiàn)的lncRNA在正常肝組織和肝癌組織中的差異性表達(dá)。原始結(jié)果已上傳至美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）中的高通量基因表達(dá)（GEO）數(shù)據(jù)庫中，提取碼為GSE98269。根據(jù)芯片結(jié)果，選擇一種在正常肝組織及肝癌組織中表達(dá)差異最顯著，且P <

0.001的lncRNA作為候選的標(biāo)志物。隨后選10份肝癌組織樣本和10份正常肝組織樣本、10份肝癌患者和10份健康對照者的血漿、10份肝癌患者和10份健康對照者的唾液，利用qPCR對候選lncRNA標(biāo)志物在這些樣本中的表達(dá)進(jìn)行更精確地定量。檢驗(yàn)2組間的差異性，若此種lncRNA在3種樣本中的表達(dá)都顯示出一致的差異性，將擴(kuò)大樣本量，進(jìn)一步驗(yàn)證該樣本是否在肝癌患者的唾液中存在顯著差異性表達(dá)。

3. lnc-JAKMIP2-1∶1表達(dá)水平的測定

組織總RNA使用TRIzol （Thermo Fisher Scientific， 美國）試劑提取，血漿和唾液總RNA使用mirVana PARIS Kit （Thermo Fisher Scientific，美國）試劑盒提取。具體提取方法嚴(yán)格按照廠家說明書。使用ReverTraAce qPCR RT Kit （Toyobo， 日本）對RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，后使用Maxima SYBR Green qPCR master mixes （Thermo Fisher Scientific， 美國）對lnc-JAKMIP2-1∶1和內(nèi)參β-actin進(jìn)行定量PCR（qPCR）反應(yīng)，測定兩者在樣本中的表達(dá)水平。qPCR使用ABI 7500 Real-Time PCR System （Thermo Fisher Scientific， 美國），反應(yīng)設(shè)置為95℃孵育10 min，然后95℃反應(yīng)15 s后再60℃反應(yīng)32 s，共40個(gè)循環(huán)。設(shè)置溶解曲線以確定反應(yīng)的特異性。每個(gè)樣本設(shè)立3個(gè)重復(fù)。lnc-JAKMIP2-1∶1的表達(dá)量使用β-actin做內(nèi)參校正。lnc-JAKMIP2-1∶1引物：上游5’-CCATTCCCAATGCCTGAACTTC-3’，下游5’-

ACAAAGTGCATACCTACCCAATG-3’;β-actin：

5’-GTCTTCCCCTCCATCGTG-3’，下游5’-AGGGTG

AGGATGCCTCTCTT-3’。lnc-JAKMIP2-1∶1的表達(dá)水平使用2-ΔΔCt計(jì)算。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0處理數(shù)據(jù)。所有數(shù)據(jù)均不符合正態(tài)分布，采用M（QL，QU）表示，2組間比較采用Mann Whitney U 檢驗(yàn)，多組間比較采用Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)，兩兩比較采用Bonferroni法校正檢驗(yàn)水準(zhǔn)，術(shù)前術(shù)后比較采用Wilcoxon 符號秩和檢驗(yàn)。定性資料用例（%）表示，其中無序分類資料組間比較采用卡方檢驗(yàn)，等級資料組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。描繪受試者工作特征（ROC）曲線，并根據(jù)該曲線獲得唾液lnc-JAKMIP2-1∶1對早期或總體肝癌診斷的靈敏度和特異度。2組間的相關(guān)性采用Spearman秩相關(guān)分析。α= 0.05。

結(jié) 果

一、3組研究對象的一般資料比較

3組研究對象的年齡（χ2 = 0.573，P = 0.632）、性別比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H = 0.917，P = 0.632）;早期、中晚期肝癌中位發(fā)病年齡分別為51、54歲左右，男女比例為73∶27。50%的肝癌患者的血清AFP正常（< 20 ng/mL），26%的患者超過提示肝癌的底限400 ng/mL，見表1。

二、候選lncRNA標(biāo)志物的挑選

基因芯片發(fā)現(xiàn)lnc-JAKMIP2-1∶1在肝癌組織中最顯著高表達(dá)（在肝癌組織的信號表達(dá)是正常肝組織的2450.3倍，P =0.0002）。因此其初步被選定為候選lncRNA標(biāo)志物。接著在肝癌組織、肝癌患者血漿、肝癌患者唾液均發(fā)現(xiàn)其顯著高表達(dá)，見圖1。同時(shí)，由于肝癌組織、血漿和唾液都來自同一批患者，利用Spearman秩相關(guān)性分析對lnc-JAKMIP2-1∶1在3種樣本中進(jìn)行兩兩比較，發(fā)現(xiàn)其在任意兩種標(biāo)本中的表達(dá)都顯著正相關(guān)。在同一批肝癌患者中，癌組織lnc-JAKMIP2-1∶1與血漿lnc-JAKMIP2-1∶1中的表達(dá)量呈兩兩顯著正相關(guān)，秩相關(guān)系數(shù)為0.806（P = 0.005）;血漿lnc-JAKMIP2-1∶1與唾液lnc-JAKMIP2-1∶1中也兩兩正相關(guān)，秩相關(guān)系數(shù)為0.891（P = 0.005）。同樣，癌組織lnc-JAKMIP2-1∶1與唾液lnc-JAKMIP2-1∶1中也兩兩正相關(guān)，秩相關(guān)系數(shù)為0.697（P = 0.025）。

三、候選lncRNA標(biāo)志物的驗(yàn)證

擴(kuò)大樣本量，選取3組，每組50例個(gè)體——健康對照組、早期肝癌組、中晚期肝癌組。然后利用qPCR對lnc-JAKMIP2-1∶1對3組個(gè)體的唾液中的表達(dá)量進(jìn)行精確定量。3組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H = 66.499，P < 0.001），兩兩比較發(fā)現(xiàn)相對于健康對照組，唾液lnc-JAKMIP2-1∶1在早期肝癌組（Z = -7.500， P < 0.05/3）、中晚期肝癌組（Z = -6.597，P < 0.05/3）中均明顯高表達(dá)，平均升高倍數(shù)分別為2.3倍和2.4倍;唾液lnc-JAKMIP2-1∶1在早期肝癌組和中晚期肝癌組的表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z = -0.193，P = 0.847），見圖2A。在早期肝癌患者接受根治性肝癌切除術(shù)后7 d以上再收集患者唾液，檢測術(shù)后患者lnc-JAKMIP2-1∶1的表達(dá)，利用Wilcoxon 符號秩和檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)唾液lnc-JAKMIP2-1∶1在根治性肝癌切除術(shù)后的表達(dá)下調(diào)（Z = -5.970，P < 0.001），見圖2B。

四、唾液lnc-JAKMIP2-1∶1對肝癌的診斷價(jià)值

通過ROC曲線分析，發(fā)現(xiàn)唾液lnc-JAKMIP2

-1∶1對早期肝癌診斷的靈敏度為100%，特異度為86%，曲線下面積（AUC）為0.946，而不論癌癥分期，唾液lnc-JAKMIP2-1∶1對整體肝癌診斷的靈敏度為94%，特異度為82%，AUC 0.909，見圖3。

討 論

本研究初步提示唾液lnc-JAKMIP2-1∶1對肝癌的早期診斷有提示作用。lnc-JAKMIP2-1∶1在肝癌患者中的癌組織、血漿和唾液中都明顯高表達(dá)，且它們的表達(dá)水平在每兩種樣本中都顯著相關(guān)。同時(shí)，在肝癌患者行根治性肝癌切除術(shù)后，唾液lnc-JAKMIP2-1∶1顯著下降，初步提示了唾液lnc-JAKMIP2-1∶1來源于肝癌的分泌，然后通過血液循環(huán)釋放到唾液中。因此，唾液lnc-JAKMIP2-1∶1對肝癌起到“液體活檢”的作用。通過ROC曲線分線，唾液lnc-JAKMIP2-1∶1診斷早期和整體肝癌的靈敏度和特異度均在80%以上。現(xiàn)時(shí)，血清甲胎蛋白是美國FDA唯一批準(zhǔn)協(xié)診肝癌的分子標(biāo)志物，非妊娠個(gè)體的血清甲胎蛋白值大于400 ng/mL，可高度懷疑罹患肝癌。但在多項(xiàng)研究中均發(fā)現(xiàn)，血清甲胎蛋白對肝癌的診斷價(jià)值較低，而在本研究中，無論早期還是晚期肝癌，只有不到30%的患者高于此值。因此，雖然血清甲胎蛋白對肝癌有提示作用，但靈敏度有限。所以在亞太肝癌臨床實(shí)踐和美國肝病研究協(xié)會的指南中均不推薦甲胎蛋白作為篩查肝癌的檢測手段[6-7]。

而此研究初步表明唾液lnc-JAKMIP2-1∶1對肝癌的診斷價(jià)值優(yōu)于血清甲胎蛋白，這對日后尋找更理想的肝癌標(biāo)志物提供了新的方向。此外，唾液lnc-JAKMIP2-1∶1在早期肝癌和中晚期肝癌的表達(dá)水平無顯著差異。這提示唾液lnc-JAKMIP2-1∶1的高表達(dá)是肝癌的早期事件，與肝癌的進(jìn)展無關(guān)，有利于肝癌的早期篩查。

唾液是由數(shù)千個(gè)大小不等的唾液腺分泌的產(chǎn)物，唾液腺被毛細(xì)血管網(wǎng)廣泛包裹纏繞，接受血液循環(huán)物質(zhì)的分泌，血液中的各種物質(zhì)，例如DNA、RNA、蛋白及代謝性產(chǎn)物等都可見于唾液。因此，唾液被認(rèn)為是血液循環(huán)的終產(chǎn)物。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA調(diào)控著人體各種生理和病理生理過程，包括癌癥的發(fā)生、發(fā)展。有研究者發(fā)現(xiàn)，lncRNA不像普通的mRNA，它高度穩(wěn)定，即使經(jīng)過多重冰凍/解凍循環(huán)、強(qiáng)酸強(qiáng)堿的腐蝕、RNA酶的消化以及處于超高溫環(huán)境中，lncRNA可依然保持完好無損[8]。同時(shí)，采集唾液無創(chuàng)、簡便，操作者無需特別培訓(xùn)，且不會引起受試者的不適，受試者依從性更好，因此唾液lncRNA作為協(xié)診疾病的分子標(biāo)志物有巨大的優(yōu)勢。多種分子物質(zhì)，已經(jīng)證明了它們在唾液中的表達(dá)，與其在血液和組織中的表達(dá)呈正相關(guān)性，例如，CRP、IL-6、HIV抗體、微RNA、前列腺特異性抗原等[9-12]。特別是HIV抗體，由于其表達(dá)與血液表達(dá)成高度正相關(guān)性，美國FDA已經(jīng)批準(zhǔn)了多款用唾液代替血液檢測HIV感染的試劑盒，并且在美國已廣泛使用[13]。因此，有理由相信唾液lncRNA有望取代血液，成為“液體活檢”的新方向。

該研究屬于癌癥標(biāo)志物的1期單中心研究，且參與的個(gè)體數(shù)量較少，因此，需要大樣本、多中心的研究以證實(shí)該發(fā)現(xiàn)。但此前期研究為未來尋找協(xié)助早診肝癌的分子標(biāo)志物提供了新的思路。

綜上所述，唾液lnc-JAKMIP2-1∶1對早期肝癌的診斷具有良好的靈敏度和特異度，它有可能在將來對罹患肝癌的高危人群，例如慢性肝炎、肝硬化患者起到早期篩查的目的。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2021-08-25）

（本文編輯：楊江瑜）