番茄灰葉斑病人工接種技術(shù)研究及抗病種質(zhì)資源篩選

張子君，孫亞男，王濤，張逸鳴，鄒慶道

（遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，遼寧沈陽(yáng) 110161）

番茄灰葉斑病在傳統(tǒng)番茄生產(chǎn)上并不是主要病害，但近20年來(lái)由于國(guó)外品種的引進(jìn)推廣，番茄灰葉斑病逐漸從次要病害上升為主要病害，并呈現(xiàn)出暴發(fā)流行的趨勢(shì)。遼寧省番茄保護(hù)地栽培面積大，栽培環(huán)境長(zhǎng)年溫暖潮濕，很適合番茄灰葉斑病發(fā)生。近年來(lái)，該病在遼寧地區(qū)發(fā)病日趨嚴(yán)重，對(duì)該病的研究也越來(lái)越受到科研人員的關(guān)注與重視。選育抗病品種是最經(jīng)濟(jì)有效的防病措施，研究、選擇適宜的抗病性鑒定方法，從而真實(shí)地反映材料抗性水平，是抗性資源篩選及抗病品種選育的關(guān)鍵和基礎(chǔ)。該研究對(duì)番茄灰葉斑病抗性鑒定方法進(jìn)行了研究，并對(duì)抗病資源進(jìn)行了篩選，以期為抗病育種工作的深入開(kāi)展提供一定指導(dǎo)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試番茄材料：LN89、LN163、金棚一號(hào)、L-402、多麗、金冠五號(hào)、金冠九號(hào)、粉太郎5號(hào)、佳寶十八、金圓寶抗T y新組合29、金圓寶抗T y新組合35、荷蘭金粉番茄抗T y、倍盈、凱美瑞、瑞菲、齊達(dá)利、粉娘、園藝紅瑪瑙。L N89是由品種桃太郎8號(hào)經(jīng)7代自交分離篩選出的穩(wěn)定自交系，LN163是由品種歐貝經(jīng)7代自交分離篩選出的穩(wěn)定自交系，經(jīng)田間觀察和預(yù)備試驗(yàn)篩選，LN89對(duì)番茄灰葉斑病抗性良好，L N163易感番茄灰葉斑病；供試病原菌匍柄霉屬茄匍柄霉（Stemphylium solani Weber）在PDA培養(yǎng)基上擴(kuò)繁，20℃培養(yǎng)10 d；供試番茄和番茄灰葉斑病病原菌材料均由遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所番茄課題組提供。

1.2 方法

1.2.1 番茄灰葉斑病人工接種。以抗病材料L N89和感病材料L N163為試材，選取6～7片真葉的番茄幼苗，分別采用噴霧法、涂抹法和菌片貼接法3種方法接種，考察不同接種方法的發(fā)病情況。其中噴霧法和涂抹法病原菌孢子濃度為7×104個(gè)/mL，噴霧法用噴壺將孢子懸浮液均勻噴霧于葉片至有水滴滴落，涂抹法用膠頭滴管吸取孢子懸液2 mL均勻涂抹在番茄植株葉片上；菌片貼接法從菌落邊緣打取直徑0.4 cm的菌片，將帶有PDA培養(yǎng)基的菌片粘貼在番茄植株葉片上，每個(gè)羽狀葉接1個(gè)菌片。接種前1 d營(yíng)養(yǎng)缽中澆足水，接種后24 h之內(nèi)保持相對(duì)濕度100%，24 h后濕度降至60%～80%，溫度控制在（23±2）℃，每天光照12 h。

采用4葉期、6葉期、8葉期的番茄幼苗，噴霧法接種，病原菌孢子濃度為7×104個(gè)/mL，考察不同苗齡接種后的發(fā)病情況。接種后保濕時(shí)間、溫度、光照條件同前。

選取6～7片真葉的番茄幼苗采用噴霧法接種，研究病原菌孢子濃度和保濕時(shí)間與發(fā)病的關(guān)系，設(shè)5×104個(gè)/mL、7×104個(gè)/mL、10×104個(gè)/mL共3個(gè)孢子濃度梯度，接種后保持相對(duì)濕度100%，設(shè)24 h、48 h、72 h、96 h共4個(gè)保濕時(shí)間梯度，接種后溫度、光照條件同前。以上每個(gè)處理接種10株，3次重復(fù)，隨機(jī)排列。

1.2.2 番茄種質(zhì)資源的抗病性鑒定。采用苗期噴霧法進(jìn)行抗病性鑒定，采用6～7葉期的番茄幼苗，病原菌孢子濃度為7×104個(gè)/mL，接種后保濕24 h。接種后溫度、光照條件同前，每個(gè)處理接種10株，3次重復(fù)，隨機(jī)排列。

1.3 測(cè)定方法

接種7 d后調(diào)查番茄植株發(fā)病情況，病害調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)參照Cho等致病力分級(jí)方法進(jìn)行分級(jí)調(diào)查。番茄灰葉斑病病情分為5級(jí)：1級(jí)，葉片上無(wú)癥狀；2級(jí)，有黑色枯死點(diǎn)，占葉面積10%以下；3級(jí)，病斑面積占葉片面積的11%～20%；4級(jí)，病斑占葉面積21%～50%；5級(jí)，病斑占葉面積50%以上。根據(jù)單株病害等級(jí)計(jì)算病情指數(shù)，再根據(jù)病情指數(shù)劃分為不同抗感類(lèi)型：0≤病情指數(shù)≤15為高抗（HR）；15＜病情指數(shù)≤30為抗病（R）；30＜病情指數(shù)≤50為中抗（M R）；50＜病情指數(shù)≤70為感病（S）；70＜病情指數(shù)≤100為高感（HS）。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄灰葉斑病人工接種技術(shù)研究

2.1.1 不同接種方法的致病效果。不同接種方法下，抗病材料L N89病情級(jí)數(shù)都是0級(jí)，沒(méi)有發(fā)病，植株正常生長(zhǎng)。感病材料L N163的發(fā)病情況以噴霧法發(fā)病最重，全株萎蔫干枯，植株基本停止生長(zhǎng)；涂抹法發(fā)病也較重，下部葉片基本已枯萎，上部葉片有大量病斑；菌片貼接法發(fā)病最輕，病斑基本未擴(kuò)展。由表1可知，噴霧法和涂抹法都能有效區(qū)分出抗感材料，抗病材料L N89表現(xiàn)為抗病，感病材料L N163表現(xiàn)為感病，真實(shí)地反映出材料的抗性水平；由于菌片貼接法發(fā)病最輕，感病材料L N163葉片只有少量病斑，表現(xiàn)為抗病，沒(méi)有真實(shí)反映出該材料的感病程度，可見(jiàn)菌片貼接法不是適宜的接種鑒定方法。噴霧法和涂抹法均是適宜番茄灰葉斑病人工接種的方法，但苗期大規(guī)模接種，以噴霧法更為簡(jiǎn)便適用。

表1 不同接種方法番茄幼苗的病情指數(shù)

2.1.2 不同苗齡番茄幼苗接種的致病效果。從表2可以看出，不同苗齡番茄幼苗接種后發(fā)病差異顯著。4葉期時(shí)感病材料L N163發(fā)病較輕，表現(xiàn)為抗病，不能真實(shí)反映出材料的抗性水平，不是適宜的接種苗齡。而6葉期和8葉期的番茄幼苗接種后均能有效地區(qū)分出抗感材料，因此，6葉期和8葉期是適宜的番茄幼苗接種苗齡。

表2 不同苗齡番茄幼苗接種番茄灰葉斑病的病情指數(shù)

2.1.3 不同接種濃度和保濕時(shí)間的致病效果。在相同的保濕時(shí)間條件下（表3），孢子濃度越大，感病材料發(fā)病越嚴(yán)重。在相同的孢子濃度下，保濕72 h和保濕96 h，植株葉片脫落嚴(yán)重，影響調(diào)查結(jié)果和后續(xù)植株定植。接種孢子濃度為5×104個(gè)/mL，保濕48 h和接種孢子濃度為7×104個(gè)/mL，保濕24 h這2個(gè)處理都能使植株充分發(fā)病。因此，6～7葉期苗齡的番茄材料適宜接種的孢子濃度和保濕時(shí)間是5×104個(gè)/mL，48 h或7×104個(gè)/mL，24 h。

表3 不同孢子濃度和保濕時(shí)間處理的番茄幼苗的病情指數(shù)

2.2 番茄主栽品種的抗病性鑒定

從表4可以看出，多麗、金冠五號(hào)和粉太郎5號(hào)表現(xiàn)為抗病；金冠九號(hào)、佳寶十八、金圓寶抗T y新組合35、荷蘭金粉番茄抗T y和倍盈表現(xiàn)為中抗；金棚一號(hào)、L-402、凱美瑞、瑞菲、粉娘和園藝紅瑪瑙表現(xiàn)為感病；金圓寶抗T y新組合29和齊達(dá)利表現(xiàn)為高感。這一結(jié)果與生產(chǎn)實(shí)踐中的觀察基本吻合，品質(zhì)粉果番茄對(duì)灰葉斑病往往有一定的抗性。

表4 不同番茄主栽品種的病情指數(shù)

3 結(jié)論與討論

噴霧接種法是番茄灰葉斑病人工接種最適宜的方法，6～8葉期為植株的適宜接種時(shí)期，適宜接種的孢子濃度和保濕時(shí)間分別為5×104個(gè)/mL，48 h或7×104個(gè)/mL，24 h。對(duì)主栽品種采用噴霧接種法進(jìn)行抗病性鑒定，篩選出3個(gè)抗病品種多麗、金冠五號(hào)和粉太郎5號(hào)，5個(gè)中抗品種金冠九號(hào)、佳寶十八、金圓寶抗T y新組合35、荷蘭金粉番茄抗T y和倍盈，其余主栽品種全部感病。

當(dāng)前生產(chǎn)上番茄灰葉斑病日趨嚴(yán)重，抗病育種工作勢(shì)在必行，而抗病資源的篩選是選育抗病品種的基礎(chǔ)和前提，建立適宜的人工接種技術(shù)體系，真實(shí)地反映資源材料的抗性水平，才能夠有效地進(jìn)行抗病資源的篩選。該試驗(yàn)結(jié)果表明，噴霧法和涂抹法是適宜的灰葉斑病接種方法，兩種方法各有優(yōu)點(diǎn)，噴霧法效率高，可以用于大量材料的接種鑒定；涂抹法效率相對(duì)較低，但可以定量接種，從而更精準(zhǔn)地反映材料的抗性水平。關(guān)于接種時(shí)期，該試驗(yàn)結(jié)果認(rèn)為6～8葉期苗齡較為適宜，但考慮到后續(xù)定植，建議選用6葉期番茄幼苗更為適宜。植物的階段抗病性較為復(fù)雜，若成株期與苗期抗性差異較大，建議結(jié)合成株期鑒定，以使結(jié)果更加可靠。接種濃度和保濕時(shí)間也是影響接種鑒定結(jié)果的重要因素，該試驗(yàn)建議適宜的接種濃度和保濕時(shí)間是5×104個(gè)/mL，48 h或7×104個(gè)/mL，24 h。該試驗(yàn)中主栽品種的抗病性鑒定中，篩選出3份抗病品種、5份中抗品種，這與生產(chǎn)實(shí)踐中的觀察結(jié)果基本一致。了解主栽品種對(duì)主要病害的抗性水平，選擇適宜當(dāng)?shù)胤N植的番茄品種，可有效降低番茄生產(chǎn)中品種選擇的盲目性，為農(nóng)民增產(chǎn)增收提供保障。