苜蓿花葉病毒和白三葉草花葉病毒復(fù)合侵染對本氏煙中5 種激素含量的影響

岳 陽，梁巧蘭，魏列新，何 輝，孟秀鵬，姜玉玲，藺 珂，陳應(yīng)娥

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院 / 甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實驗室，甘肅 蘭州 730070）

植物激素(plant hormone)是植物自身代謝產(chǎn)生的、在極低濃度下可對植物的生命活動起調(diào)控作用的有機(jī)物質(zhì)，水楊酸(salicylic acid, SA)、獨腳金內(nèi)酯(strigolactone, SLs)和油菜素內(nèi)酯(brassinolide, BR)均可促進(jìn)植物的光合作用、提高葉綠素含量、維持植物的直立與葉片形態(tài)、促進(jìn)植物生長和分蘗[1-7]；而茉莉酸(jasmonic acid, JA)通過調(diào)控乙烯(ethylene,ETH)含量變化調(diào)節(jié)植物生長和葉片脫落、誘導(dǎo)卷須卷曲、促進(jìn)氣孔關(guān)閉[8]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)生物脅迫和非生物脅迫均會引起植物體內(nèi)激素的變化[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，玉米褪綠斑駁病毒(maize chlorotic mottle virus, MCMV)侵染玉米(Zea mays)后會導(dǎo)致寄主新葉縮小，老葉皺縮萎蔫，誘導(dǎo)SA、JA、SLs 和BR 積累[9-10]。其中SA 作為信號分子，可提高植株體內(nèi)可溶性糖、蛋白和游離脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量以及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化物酶(peroxide, POD)和過氧化氫酶(catalase, CAT) 3 種抗氧化酶活性，保護(hù)葉綠體，提高氣孔導(dǎo)度和降低丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量[3]；而JA 會誘導(dǎo)蛋白酶抑制劑、苯丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶等與抗性有關(guān)的基因表達(dá)以提高植物抗逆性[11]；SLs 在逆境下可消除活性氧自由基對植物的危害，其合成基因的表達(dá)水平受到SA、JA 和ETH 的調(diào)控，與SA 協(xié)同抑制病毒可進(jìn)行自我復(fù)制，減少病毒數(shù)量，阻礙病毒在細(xì)胞間的傳播[2,5,9]；BR則在植物生長過程中能夠增加有機(jī)物的合成、促進(jìn)核酸和蛋白質(zhì)的代謝，維持受到病毒脅迫后葉片的平展[12]；ETH 合成受到SA、BR 的調(diào)控，與SA 和JA 介導(dǎo)的信號途徑發(fā)生協(xié)同作用，共同激活由SA、JA 和ETH 信號途徑組成的協(xié)同防御系統(tǒng)，調(diào)控脂肪氧化酶(lipoxygenase, LOX)、CAT、抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase, APX)活性和H2O2含量，誘導(dǎo)產(chǎn)生病程相關(guān)蛋白(pathogenesis-related protein, PR)等抗病蛋白，使植物系統(tǒng)獲得系統(tǒng)獲得性抗性(systematic acquired resistance, SAR)[13-14]。因此，這5 種激素可共同抵御病毒等病原物侵染危害[1]。

植物在生長過程中常常會受到不同病毒的多次侵染或復(fù)合侵染，這種現(xiàn)象十分普遍。據(jù)報道，在馬鈴薯(Solanum tuberosum) X 病毒與馬鈴薯Y 病毒、大豆花葉病毒(soybean mosaic virus, SMV)與菜豆莢斑駁病毒(bean pod mottle virus, BPMV)、小麥線條花葉病毒(wheat streak mosaic virus, WSMV)與玉米矮花葉病毒(maize dwarf mosaic virus, MDMV)、甘薯羽狀斑駁病毒(sweet potato feathery mottle virus, SPFMV)與甘薯褪綠矮化病毒(sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)之間存在復(fù)合侵染現(xiàn)象，這些病毒在侵染寄主后發(fā)生協(xié)生作用，導(dǎo)致寄主出現(xiàn)比其中任意一種病毒侵染更加嚴(yán)重的癥狀[15-16]。引起苜蓿(Medicago sativa)病毒病的主要病原苜蓿花葉病毒(alfalfa mosaic virus, AMV)是苜蓿花葉病毒屬中寄主最多的植物病毒，可以侵染包括苜蓿、白三葉草(Trifolium repens)、 豇豆(Vigna unguiculata)、 煙草(Nicotiana tabacum)、 辣椒 (Capsicum annuum)等51 科430 多種植物[17]，常常在苜蓿、三葉草、豇豆和煙草等植物中與白三葉草花葉病毒(white clover mosaic virus, WCMV)、菜豆黃花葉病毒(bean yellow mosaic virus, BYMV)、豇豆花葉病毒(cowpea mosaic virus, CPMV)、紅三葉草明脈花葉病毒(red clover vein mosaic virus, RCVMV)、煙草花葉病毒(tobacco mosaic virus, TMV)、黃瓜花葉病毒(cucumber mosaic virus, CMV)、大豆花葉病毒等發(fā)生復(fù)合侵染，同樣加重病害發(fā)生[18-19]；其中，AMV 與WCMV 復(fù)合侵染白三葉草的田間復(fù)合侵染率高達(dá)83.3%[20]，在復(fù)合侵染的寄主體內(nèi)2 種病毒的含量分別是單獨侵染寄主體內(nèi)病毒含量的5.897 和3.515 倍[21]；復(fù)合侵染苜蓿后使葉片中與抗病性相關(guān)的多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)、過氧化物酶(peroxidase, POD)和苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase, PAL) 3 種防御酶活性顯著升高、葉綠素和可溶性蛋白含量均降低，AMV 和WCMV 復(fù)合侵染苜蓿、三葉草等豆科牧草后，嚴(yán)重影響牧草的生長，使牧草產(chǎn)量降低[22]。

但是，有關(guān)AMV 和WCMV 復(fù)合侵染后，隨著時間的延長是否會通過誘導(dǎo)寄主植物中SA、JA、SLs、BR 和ETH 的積累或減少來影響植物的正常生長，以及各激素之間的協(xié)同關(guān)系等問題尚未見系統(tǒng)報道。為此，本研究以提純的AMV、WCMV 和不同比例混合的AMV、WCMV 病毒液接種本氏煙(Nicotiana benthamiana)，通過測定不同時間下5 種激素的含量及變化，旨在明確AMV 和WCMV 復(fù)合侵染對寄主中SA、JA、SLs、BR 和ETH 等激素含量的影響，這對進(jìn)一步從植物內(nèi)源激素變化方面揭示AMV 和WCMV 復(fù)合侵染寄主的致病機(jī)理具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試材料

本氏煙：2020 年秋季種植于發(fā)光二極管(light emitting diode, LED)頂置人工氣候箱中，溫度25 ℃、16 h/8 h(L/D)、相對濕度60%、光照8 000 lx，共120株，備用。

AMV 和WCMV 病毒：保存于?80 ℃冰箱中，濃度300 pg·mL?1，備用。

AMV 和WCMV DAS-ELISA 定量檢測試劑盒購自江蘇晶美生物科技有限公司；SA、JA、SLs、BR、ETH ELISA 定量檢測試劑盒 購自江蘇晶美生物科技有限公司。

0.02 mol·L?1磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer solution, PBS)：pH 7.0、pH 7.2。

1.1.2 供試儀器設(shè)備

試驗設(shè)備：立式高壓蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)、電熱恒溫水浴鍋(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)、高速冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf 公司)。

試驗儀器：酶標(biāo)儀(美國Biotek 公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 病毒接種處理

分別將AMV 和WCMV 按照體積比1 ? 0、0 ? 1、1 ? 1、1 ? 3、3 ? 1 混合，然后取各病毒液1 mL 分別加PBS 緩沖液(pH 7.0) 4 mL，稀釋成5 倍病毒液，從上述種植的本氏煙中選取60 株健康的、長勢一致、4～5 片葉的幼苗，使用摩擦接種法，接種前用滅菌水沖洗接種葉，待葉片干凈后輕輕灑少許金剛砂，并滴加0.1 mL 病毒液，用指腹小心摩擦接種[22]，每株接種3 片葉，以只接種0.1 mL 0.02 mol·L?1PBS 緩沖液(pH 7.0)的本氏煙為對照，每個處理重復(fù)接種10 株，接種后用蒸餾水沖洗葉片上多余的病汁液，然后將幼苗置于人工氣候箱中，定時定量澆灌營養(yǎng)液培養(yǎng)，并觀察發(fā)病情況，待發(fā)病后進(jìn)行帶毒檢測及病毒含量測定。

1.2.2 接種的本氏煙病毒含量檢測

2 種病毒含量標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：設(shè)空白孔和標(biāo)準(zhǔn)孔，分別取AMV 和WCMV 檢測試劑盒中提供的AMV、WCMV 標(biāo)準(zhǔn)品，使用試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液將AMV 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至15、30、60、120、240 pg·mL?1，將WCMV標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至12.5、25、50、100、200 pg·mL?1，然后分別取稀釋好的不同濃度的2 種病毒標(biāo)準(zhǔn)品分別加入各自配套的酶標(biāo)板上的不同標(biāo)準(zhǔn)孔內(nèi)，每孔加標(biāo)準(zhǔn)品50 μL；按照AMV、WCMV 檢測試劑盒的產(chǎn)品說明書操作步驟進(jìn)行，反應(yīng)完成后每孔加反應(yīng)終止液50 μL 終止反應(yīng)，以空白孔調(diào)零，用酶標(biāo)儀在15 min內(nèi)測定各孔450 nm 下的吸光值，以AMV、WCMV標(biāo)準(zhǔn)品不同濃度為橫坐標(biāo)x，以不同濃度下450 nm處吸光值為縱坐標(biāo)y，在Excel 2010 中制作標(biāo)準(zhǔn)曲線y=ax+b。

接種幼苗病毒含量檢測：取上述接種病毒72 h后的幼苗葉片，去葉脈后稱取0.5 g，放入冰凍的研缽后，以1 ? 4 的比例加入PBS 緩沖液(pH 7.0)冰浴研磨后于4 ℃下2 000 r·min?1離心20 min，取上清液備用；在酶標(biāo)板上設(shè)置陰性對照孔、陽性對照孔、空白對照孔(空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑)和待測樣品孔；陰性對照孔、陽性對照孔中分別加入陰性對照、陽性對照50 μL，待測樣品孔中先加入樣品稀釋液40 μL，再加入離心后的上清液10 μL，不同處理做不同標(biāo)記，每個處理重復(fù)3 次；然后按照AMV、WCMV 檢測試劑盒的產(chǎn)品說明書操作步驟進(jìn)行。反應(yīng)終止后以空白對照孔調(diào)零，利用酶標(biāo)板在450 nm 處測定OD 值，當(dāng)陽性對照孔平均值≥ 1.00、陰性對照孔平均值 ≤ 0.10 即可判定試驗有效；計算臨界值(臨界值 = 陰性對照孔平均值 +0.15)；當(dāng)樣品孔的OD 值 ≥ 臨界值即為AMV 或WCMV 陽性；并將測得的OD 值代入制作好的標(biāo)準(zhǔn)曲線中，求出x值，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品中病毒濃度。

1.2.3 接種AMV 和WCMV 的本氏煙中5 種激素含量測定

5 種激素含量標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：從5 種激素的檢測試劑盒中取出5 種激素標(biāo)準(zhǔn)品，按照各試劑盒說明書進(jìn)行稀釋，樣品稀釋液取自各試劑盒。SA 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至75、150、300、600、1 200 pmol·L?1，JA 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至62.5、125、250、500、1 000 pmol·L?1，SLs 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至3、6、12、24、48 ng·L?1，BR 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至7.5、15、30、60、120 ng·L?1，ETH 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至20、40、80、160、320 ng·L?1，并設(shè)空白對照孔，每個處理重復(fù)3 次；然后分別按照各激素檢測試劑盒說明書的操作步驟進(jìn)行，待反應(yīng)完成后加入終止液，在15 min 內(nèi)用酶標(biāo)儀測定450 nm 處的吸光值，以5 種激素標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)x，以不同激素不同濃度對應(yīng)的吸光值為縱坐標(biāo)y，使用Excel 2010 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線y=ax+b。

5 種激素樣品液提取：分別于不同接種處理72、144、216、360、432、504、576、648、720 h 時剪去本氏煙葉片(去葉脈)，稱取0.2 g，立即放入?20 ℃冷凍的研缽中，加入少許石英砂和0.8 mL 0.02 mol·L?1的PBS 緩沖液(pH 7.2)冰浴研磨后轉(zhuǎn)入1.5 mL 尖底離心管中，于4 ℃下2 500 r·min?1離心20 min，將上清液小心轉(zhuǎn)移到滅菌離心管中，即為5 種激素樣品提取液，立即轉(zhuǎn)移至冰浴中，備用。

激素含量的測定：取上述提取的樣品液10 μL加入試劑盒提供的對應(yīng)樣品稀釋液(40 μL)中(稀釋5 倍)，每種激素各設(shè)空白對照孔、樣品孔，按照產(chǎn)品說明書步驟進(jìn)行5 種激素含量的測定，于450 nm處測得吸光值后，將待測樣品吸光值代入各激素標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程中，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品中各激素的實際濃度，將各激素濃度換算為每克鮮葉中的激素含量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 25.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和方差分析，用平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤描述測定結(jié)果，對同一時間不同處理的數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，并用Duncan 法對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較；采用Excel 2010 進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制、數(shù)據(jù)整理及制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 本氏煙幼苗AMV 和WCMV 帶毒檢測

2.1.1 AMV 和WCMV 濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

DAS-ELISA 定量檢測AMV 的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=226.63x?10.162(r= 0.999 2)；WCMV 的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=145.17x+6.281 3(r= 0.992 6)。

2.1.2 本氏煙幼苗AMV 和WCMV 檢測

采用DAS-ELISA 方法檢測接種72 h 的本氏煙葉片中AMV、WCMV 帶毒情況及濃度，結(jié)果表明2 種病毒按1 ? 1、1 ? 3 和3 ? 1 混合接種和單獨接種處理的10 株幼苗葉片， 均表現(xiàn)為AMV 和WCMV 陽性及AMV 或WCMV 陽性，帶毒檢出率均為100%。3 個不同比例接種2 種病毒混合液的處理中1 ? 1 比例時AMV、WCMV 濃度分別為178.65、153.72 pg·mL?1，1 ? 3 比例時AMV、WCMV 濃度分別為138.83 和152.60 pg·mL?1，均低于AMV、WCMV 單獨接種的病毒濃度(328.28 和270.94 pg·mL?1)。AMV 和WCMV 以3 ? 1 比例接種后本氏煙葉片中2 種病毒濃度分別為344.97、216.61 pg·mL?1，其中AMV 濃度高于單獨接種AMV 的本氏煙葉片中AMV 濃度(表1)。

表1 接種72 h 后本氏煙葉片中AMV 和WCMV 病毒的濃度Table 1 Concentration of AMV and WCMV in Nicotiana benthamiana leaves after 72 hours of inoculation pg·mL?1

接種病毒720 h 后，復(fù)合侵染癥狀明顯重于單獨侵染，其中AMV 和WCMV (3 ? 1)混合液復(fù)合侵染本氏煙葉片癥狀最明顯，出現(xiàn)了嚴(yán)重花葉、明脈的癥狀；AMV 和WCMV (1 ? 1)混合液侵染本氏煙葉片表現(xiàn)出明脈、斑駁癥狀；AMV 和WCMV (1 ? 3)混合液侵染本氏煙葉片表現(xiàn)出較嚴(yán)重的皺縮、輕微斑駁花葉；AMV 單獨侵染后本氏煙葉片出現(xiàn)斑駁花葉、明脈癥狀；WCMV 單獨侵染后本氏煙葉片則出現(xiàn)輕花葉癥狀；對照(CK)表現(xiàn)健康、無癥狀(圖1)。

圖1 AMV 和WCMV 復(fù)合侵染720 h 時本氏煙葉片癥狀表現(xiàn)Figure 1 Symptoms on leaf inoculated with AMV and WCMV at 720 h in Nicotiana benthamiana

2.2 接種AMV 和WCMV 對本氏煙葉片5 種激素含量的影響

2.2.1 5 種激素含量標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

通過DAS-ELISA 方法對5 種激素不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的OD 值進(jìn)行測定，建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為：

2.2.2 水楊酸含量的變化

測定接種病毒后本氏煙葉片中的SA 含量(圖2)發(fā)現(xiàn)，接種AMV 和WCMV 混合液及單獨接種AMV或WCMV 后本氏煙葉片中SA 含量均高于健康植株(CK)，并且SA 含量隨著接種時間的增加表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，在接種兩種病毒混合液(3 ? 1、1 ? 1、1 ? 3) 72 h 時SA 含量值最低，比單獨接種WCMV 的本氏煙中SA 含量分別降低了12.33%、38.98%和14.69%，AMV 和WCMV 接種比例為3 ? 1和1 ? 3 的比單獨接種AMV 的本氏煙中SA 含量分別提高了2.82%和0.70%，AMV 和WCMV 接種比例為1 ? 1 處理的SA 含量低于單獨接種AMV 處理，高于CK；SA 含量在接種AMV 和WCMV 混合液(3 ? 1、1 ? 1、1 ? 3) 360 h 時達(dá)到最高值，分別為5.22、4.40 和3.89 ng·g?1，比單獨接種AMV 的本氏煙葉片中SA 含量分別高61.61%、36.22%和20.43%，比單獨接種WCMV 的本氏煙葉片中SA 含量分別高63.13%、37.50%和21.56%，比CK 分別高92.62%、62.36%和43.54%；144～720 h 時，AMV 和WCMV接種比例為3 ? 1 和1 ? 1 的本氏煙中SA 含量顯著高于單獨接種AMV、WCMV 和CK (P< 0.05)；在不同測定時間，各接種處理植株葉片的SA 含量之間均存在明顯差異。

圖2 接種AMV 和WCMV 對本氏煙葉片中水楊酸含量的影響Figure 2 Effects of inoculation with AMV and WCMV on salicylic acid (SA) content in Nicotiana benthamiana leaves

2.2.3 茉莉酸含量的變化

測定接種病毒后本氏煙葉片中JA 含量(圖3)發(fā)現(xiàn)，接種AMV 和WCMV 混合液及單獨接種AMV 或WCMV 后本氏煙葉片中JA 含量除648 和720 h 外均低于健康植株(CK)，并且JA 含量隨著接種時間的增加表現(xiàn)出先降低后升高的趨勢，其中在接種兩種病毒混合液(3 ? 1、1 ? 1、1 ? 3) 360 h時本氏煙葉片中JA 含量降至最低，分別為0.54、0.72 和1.10 ng·g?1，比單獨接種AMV 本氏煙葉片中JA 含量分別低59.09%、45.45%和16.67%，比單獨接種WCMV 本氏煙葉片中JA 含量分別低61.43%、48.57%和21.43%，比CK 分別低66.46%、55.28%和31.68%；JA 含量在接種兩種病毒混合液(3 ? 1、1 ? 1、1 ? 3) 720 h 時本氏煙葉片中達(dá)到最大，分別為2.44、2.34 和2.25 ng·g?1，除了以1 ? 3 比例接種外，接種其余兩個比例混合液均使得本氏煙葉片中JA 含量高于單獨接種AMV和WCMV、 CK， 比單獨接種AMV 分別高11.93%和7.34%，比單獨接種WCMV分別高8.93%和4.46%， 比CK 分別高5.17%和0.86%；接種兩種病毒混合液(3 ? 1、1 ? 1、1 ? 3) 72 h時的本氏煙葉片中JA 含量僅次于720 h，高于其余接種時間的JA 含量，分別為1.91、2.03 和2.07 ng·g?1，比單獨接種AMV 和WCMV 均高30.19%以上；接種時長在576 和720 h 時，所有處理之間均無顯著差異，除此之外，其余接種時間下各接種處理間差異明顯。

圖3 接種AMV 和WCMV 對本氏煙葉片中茉莉酸含量的影響Figure 3 Effects of inoculation with AMV and WCMV on jasmonic acid (JA) content in Nicotiana benthamiana leaves

2.2.4 獨角金內(nèi)酯含量的變化

測定接種病毒后本氏煙葉片中SLs 含量(圖4)發(fā)現(xiàn)，接種AMV 和WCMV 混合液及單獨接種AMV或WCMV 后本氏煙葉片中SLs 含量除720 h 接種比例3 ? 1 處理外均高于健康植株(CK)，并且SLs 含量隨著接種時間的增加表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，其中SLs 含量在AMV 和WCMV 接種比例為3 ? 1 處理360 h 時達(dá)到最大，為1.39 ng·g?1，此時，其比單獨接種AMV 和WCMV、CK 分別高36.27%、39.00%和69.51%；SLs 含量在接種兩種病毒混合液(3 ? 1、1 ? 1、1 ? 3) 72 h 時降到最小，分別為0.61、0.53 和0.44 ng·g?1，其中，AMV 和WCMV 的接種比例為3 ? 1 的處理比單獨接種AMV、WCMV 和CK 中的SLs 含量分別高10.91%、12.96%和56.41%，而接種比例分別為1 ? 1 和1 ? 3 的處理中SLs 含量均低于單獨接種AMV、 WCMV 處理， 但高于CK； 在216～648 h 接種時間內(nèi)，接種比例為3 ? 1 和1 ? 1 的處理與其余處理植株葉片的SLs 含量之間存在明顯差異。

圖4 接種AMV 和WCMV 對本氏煙葉片中獨腳金內(nèi)酯含量的影響Figure 4 Effects of inoculation with AMV and WCMV on strigolactones (SLs) content in Nicotiana benthamiana leaves

2.2.5 油菜素內(nèi)酯含量的變化

測定接種病毒后本氏煙葉片中BR 含量(圖5)發(fā)現(xiàn)，接種AMV 和WCMV 混合液及單獨接種AMV或WCMV 后本氏煙葉片中BR 含量除處理648 h 外其余處理時間均高于健康植株(CK)，并且BR 含量隨著接種時間的增加表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，其中BR 含量在接種兩種病毒混合液(3 ? 1、1 ? 1、1 ?3) 360 h 時的本氏煙葉片中達(dá)到最大，分別為3.73、3.15 和2.64 ng·g?1，比單獨接種AMV 處理分別高63.60%、38.16%和15.79%，比單獨接種WCMV 處理分別高60.78%、35.78%和13.79%，比CK 分別高81.95%、53.66%和28.78%；BR 含量在AMV 和WCMV接種比例為3 ? 1 處理 720 h 時降至最小，為1.27 ng·g?1，此時，其比單獨接種AMV 和WCMV 處理分別低19.69%和16.54%，比CK 高30.93%；在360 和504 h 接種時間下各接種處理植株葉片的BR 含量之間有明顯差異。

圖5 接種AMV 和WCMV 對本氏煙葉片中油菜素內(nèi)酯含量的影響Figure 5 Effects of inoculation with AMV and WCMV on brassinolide (BR) content in Nicotiana benthamiana leaves

2.2.6 乙烯含量的變化

測定接種病毒后本氏煙葉片中ETH 含量(圖6)發(fā)現(xiàn)，接種AMV 和WCMV 混合液及單獨接種AMV 或WCMV 后本氏煙葉片中ETH 含量均高于健康植株(CK)，并且ETH 含量隨著接種時間的增加表現(xiàn)出先升高、后降低、再升高、再降低的趨勢，其中ETH 含量在接種兩種病毒混合液(3 ? 1、1 ? 1、1 ? 3) 648 h 時達(dá)到最大，分別為8.32、7.19 和6.51 ng·g?1，此時，3 個處理分別比單獨接種AMV 處理高66.07%、43.51%和29.94%，分別比單獨接種WCMV處理高63.46%、41.26%和27.90%，分別比CK 高108.52%、80.20%和63.16%；ETH 含量在接種兩種病毒混合液(3 ? 1、1 ? 1、1 ? 3) 360 h 時的本氏煙葉片中略低于648 h，分別為6.26、5.69、5.19 ng·g?1，此時，3 個處理分別比單獨接種AMV 處理高38.50%、25.89%和14.82%，分別比單獨接種WCMV 處理高31.51%、 19.54%和9.03%， 分別比CK 高65.17%、50.13%和36.94%；ETH 含量在AMV 和WCMV 接種比例為3 ? 1 處理72 h 時降至最小，為1.60 ng·g?1，此時，比單獨接種AMV 和WCMV 分別低30.63%和35.00%，比CK 高10.35%；72～720 h 不同接種時間下各接種處理植株葉片的ETH 含量之間差異明顯。

圖6 接種AMV 和WCMV 對本氏煙葉片中乙烯含量的影響Figure 6 Effects of inoculation with AMV and WCMV on ethylene (ETH) content in Nicotiana benthamiana leaves

3 討論與結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，接種AMV 和WCMV 混合液(3 ? 1)后復(fù)合侵染的本氏煙葉片癥狀明顯重于接種AMV和WCMV 混合液(1 ? 1、1 ? 3)及單獨接種AMV 或WCMV 本氏煙癥狀；而且在接種72 h 后，接種葉中AMV 濃度明顯高于其他處理，WCMV 濃度除了略低于單獨接種WCMV 的濃度外均高于其他處理。接種AMV 和WCMV 混合液的本氏煙葉片中SA、JA、SLs、BR 和ETH 含量分別在144～432 h、72～504 h、360～432 h、360～504 h 和288～648 h 與單獨接種AMV、WCMV 及健康植株葉片中的含量之間有明顯差異。接種AMV 和WCMV 混合液(3 ? 1)的本氏煙葉片中SA、SLs、BR 和ETH 4 種激素的含量分別在360、360、360、648 h 達(dá)到最高，顯著高于單獨接種AMV、WCMV 和健康植株(CK)，與單獨接種AMV 和WCMV、CK 本氏煙葉片中4 種激素含量相比，SA 含量分別提高了61.61%、63.13%、92.62%，SLs 含量分別提高了36.27%、39.00%和69.51%，BR含量分別提高了63.60%、60.78%和81.95%，ETH 含量分別提高了66.07%、63.46%和108.52%；72～504 h 時，接種AMV 和WCMV 混合液(3 ? 1)的本氏煙葉片中JA 含量均明顯低于單獨接種AMV、WCMV和健康植株(CK)，其中接種360 h 時分別降低了59.09%、61.43%和66.46%。

SA 和JA 是植物體內(nèi)重要的信號分子，在植物防御病原菌入侵過程中扮演著重要角色[23]。SA 化學(xué)名為鄰羥基苯甲酸，是植物體內(nèi)的小分子酚類物質(zhì)，參與活體或半活體營養(yǎng)型病原菌引發(fā)的抗病并誘發(fā)植物的系統(tǒng)獲得性抗性。JA 化學(xué)名稱為3-氧-2-(2’-戊烯基)-環(huán)戊烷乙酸，是一種脂肪酸類的信號分子，參與死體營養(yǎng)型病原菌及其昆蟲誘導(dǎo)的抗病并激發(fā)植物的誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性(induced systemic resistance, ISR)。大量研究表明，當(dāng)植物受到病原侵染后，體內(nèi)SA、JA 和ETH 等信號分子將引起一系列的抗病信號傳導(dǎo)，調(diào)控SLs 和BR 等相關(guān)激素的合成，最終激活病程相關(guān)基因(pathogenesis-related genes, PR)的表達(dá)[14]。

據(jù)報道，生物脅迫會導(dǎo)致寄主植物激素水平發(fā)生變化，植物響應(yīng)逆境條件時，可以通過調(diào)節(jié)自身的激素合成量來增強(qiáng)抗逆性。病毒脅迫會導(dǎo)致寄主植物葉片中的SA、JA 和BR 積累并觸發(fā)病原物相關(guān)分子模式觸發(fā)式免疫(pattern-triggered immunity,PTI)[7,10,24-26]。擬南芥(Arabidopsis thaliana)感染AMV后，會通過調(diào)節(jié)JA 和SA 的合成相關(guān)基因來減輕病毒侵染對自身活力的影響[27]，在病原菌脅迫下SLs 相關(guān)基因能夠在維管組織和輸導(dǎo)組織中大量表達(dá)，促進(jìn)可阻礙病原菌在胞間連絲中傳導(dǎo)的胼胝質(zhì)的生成[9]；同時在逆境脅迫下各激素間表現(xiàn)為協(xié)同或拮抗作用，組成抗脅迫網(wǎng)絡(luò)，抵抗病害的發(fā)生；而ETH 含量隨著SA 和BR 含量的升高而升高，SA 和BR 可促進(jìn)ETH 的合成。有研究表明，SA 和JA 之間表現(xiàn)為拮抗作用[23]。玉米在抗MCMV 脅迫時SA 和BR 表現(xiàn)為協(xié)同作用，而與JA 之間表現(xiàn)為拮抗作用[10]；寄主植物的癥狀表現(xiàn)也與激素水平的變化有關(guān)[28]，出現(xiàn)植物組織變色、壞死、畸形等癥狀的根本原因就是病毒入侵寄主后對寄主激素代謝水平產(chǎn)生了一定的干擾[14]。5 種激素中，SA、SLs 和BR 均可以促進(jìn)植物的光合色素合成和氣孔關(guān)閉、提高光合速率、維持植株生長[1,4,6]，JA、ETH 可以延緩植株生長、促進(jìn)葉片衰老和脫落[11-12]。本研究也發(fā)現(xiàn)，接種AMV 和WCMV 兩種病毒混合液(3 ? 1、1 ? 1)后，可提高本氏煙葉片中SA (144～720 h)、SLs(216～648 h)、BR (288、360、504 h)和ETH (216～360 h、504～648 h)含量，其含量均明顯高于接種單個病毒處理和對照，JA 含量則是在216～504 h 低于接種單個病毒處理和對照，而且?guī)追N激素的相互作用使本氏煙葉片表現(xiàn)出重花葉、斑駁輕花葉、明脈、皺縮等不同的癥狀類型，產(chǎn)生不同程度的過敏反應(yīng)，當(dāng)復(fù)合接種發(fā)病的本氏煙中病毒含量越大、癥狀越嚴(yán)重時葉片中SA、SLs、BR 和 ETH 含量越大，而JA 含量越小；432～720 h 時ETH 含量先隨著SA、SLs 和BR 含量的降低而降低，之后受到JA 的促進(jìn)作用，與JA 一起大量合成、積累[29]，植株葉片變小、生長速度降低，導(dǎo)致了本氏煙植株的衰亡。

本研究僅針對AMV、WCMV 復(fù)合侵染本氏煙中5 種激素含量變化進(jìn)行了檢測，證明了AMV、WCMV 復(fù)合侵染存在協(xié)生作用，提高了寄主植物葉片內(nèi)病毒濃度并加重了癥狀表現(xiàn)，明確了AMV 和WCMV 復(fù)合侵染對本氏煙720 h 內(nèi)5 種激素含量影響的變化規(guī)律。但是，由于苜蓿葉片較小、表面具絨毛、采用摩擦接種病毒發(fā)病慢，故只選擇使用模式作物本氏煙來進(jìn)行試驗；有關(guān)AMV 和WCMV 復(fù)合侵染苜蓿后葉片中激素含量變化與兩種病毒復(fù)合侵染致病機(jī)理之間的關(guān)系、AMV 和WCMV 復(fù)合侵染本氏煙與苜蓿后5 種激素之間的協(xié)同關(guān)系以及對寄主光合色素合成及光合速率、苜蓿品質(zhì)的影響等問題尚未涉及，還有待進(jìn)一步的研究。