甘草幼苗響應干旱脅迫的光合、抗氧化特性及轉錄組分析

關思靜，王 楠，徐蓉蓉，葛甜甜，高 靜，彭 亮，張 崗，陳 瑩

（1. 陜西中醫藥大學藥學院 / 陜西省秦嶺中草藥應用開發工程技術研究中心, 陜西 咸陽 712046；2. 陜西中醫藥大學 / 陜西中藥資源產業化省部共建協同創新中心, 陜西 咸陽 712083）

烏拉爾甘草(Glycyrrhiza uralensis)為豆科多年生草本植物，其根及根莖富含黃酮類、三萜類以及多糖等活性物質，具有抗炎、抗癌、抗病毒、抗氧化等藥理作用，是一種常用的中草藥[1-2]。甘草不僅具有較高的藥用價值，而且具有很強的固沙能力，是西北干旱地區重要的植物資源[3]。但是，近年來隨著人們對甘草需求的日益增長，導致其野生資源逐漸枯竭，人工栽培成為解決甘草資源危機的可能途徑之一。然而有研究表明，人工栽培甘草其抗逆性低于野生甘草[4]，且質量參差不齊。因此，提高甘草抗旱性及品質是目前甘草種植產業亟待解決的問題。

干旱是一種外界的逆境脅迫，已經成為藥用植物生產力的主要限制因素之一。干旱脅迫會導致植物體內活性氧(reactive oxygen species, ROS)的積累，引起膜脂的廣泛過氧化和去酯化，并使蛋白質變性和核酸突變[5]。在生物進化過程中，植物形成了一套減少或消除ROS 的保護酶系統，包括過氧化氫酶(catalase, CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、過氧化物酶(peroxide, POD)等[6]。研究表明，植物遭受干旱脅迫時還會提高抗氧化酶基因的轉錄水平，如小麥(Triticum aestivum)根系中ROS 代謝相關基因谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase 7, GPX7)、抗壞血酸過氧化物酶3 (ascorbate peroxidase 3,APX3)、谷胱甘肽S -轉移酶(glutathione transferases 8, GST8和Glutathione S-transferase 18,GST18)和GSTU11(Glutathione S-transferase 11)在干旱脅迫下均顯著上調[7]。

土壤干旱會導致植物根部產生脫落酸(abscisic acid, ABA)，根源信號ABA 到達葉片，進而促進氣孔關閉，減少CO2的進入，抑制光合作用[8]。除此之外，干旱脅迫也能通過葉綠素降解、光化學系統損壞等造成光合速率下降[9]。Gleason 等[10]在研究玉米(Zea mays)對干旱脅迫的反應時發現，其光合特性、水力傳導以及氣孔導度(stomatal conductance, Gs)均大幅降低。雷蕾和張彥妮[11]研究發現，干旱脅迫降低了黃連花(Lysimachia davurica)的凈光合速率(net photosynthetic rate, Pn)、蒸騰速率(transpiration rate, Tr)和Gs，同時提高了胞間CO2濃度(intercellular CO2concentration, Ci)。

植物適應逆境脅迫的響應包含形態、生理生化和分子上的改變，這些改變又是眾多基因表達改變而引起的。參與抗旱的重要基因一般分為兩大類：功能基因和調節基因，前者編碼重要的代謝蛋白和酶，直接保護植物細胞免受干旱脅迫的侵害；后者則編碼調控蛋白，如轉錄因子、蛋白激酶等，這些蛋白主要在脅迫響應中進行信號轉導和綜合調控下游應答基因[12]。值得注意的是，其中轉錄因子可以通過ABA 依賴/獨立的途徑被激活，參與調控下游基因的轉錄表達，在植物抵御干旱脅迫中扮演著重要角色[13]。隨著高通量測序技術的不斷發展，研究藥用植物在轉錄組水平上與抗旱性相關的特定基因表達和分子機制已十分普遍。如李鉑等[14]研究結果表明，以聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)模擬干旱脅迫下半夏(Pinellia ternata)莖中編碼植物激素與信號轉導、氧化還原相關酶等基因表達水平顯著上升；李曉艷等[15]利用轉錄組數據揭示了在適度干旱脅迫下，bHLH (basic-helix-loop-helix)、bZIP(basic leucine zipper)、MYB (v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)、WRKY 類轉錄因子在丹參(Salvia miltiorrhiza)根和葉中差異表達均顯著，且可能參與調控萜類基因的表達，這為研究中藥材對環境脅迫的應答機制提供了豐富的基因信息。本研究旨在對干旱脅迫下甘草光合生理、抗氧化酶活性的變化進行分析，并利用轉錄組高通量測序方法，分析干旱脅迫對甘草不同部位基因表達的調控特征，以期為進一步篩選抗旱相關基因、提高甘草干旱脅迫耐受性奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理條件

烏拉爾甘草種子購自峰華農業有限公司。挑選健康飽滿的種子浸泡在體積比為1 ? 3 的30%過氧化氫 ? 純凈水溶液中消毒30 min，洗凈后，放入鋪有兩層濾紙的培養皿中，適量加水后于25 ℃恒溫氣候箱中進行催芽萌發。待子葉完全展開，挑選生長一致的幼苗移至塑料水培盆中，以純凈水澆灌幼苗培養24 h，更換后采用Hoagland 全營養液水培4 周。隨后處理組用Hoagland 全營養液配制15%聚乙二醇(polyethylene glycol 6000, PEG-6000)溶液模擬干旱脅迫[16]，以不加PEG-6000 的Hoagland 全營養液培養的幼苗為對照組。處理時間均為7 d。各處理設3 次生物學重復。

1.2 生理指標測定方法

分別于脅迫處理0 (CK)、1、3、5、7 d 時，選取各處理植株完全展開葉用CIRAS-3 光合儀測定葉片Pn、Gs、Tr、Ci4 項光合作用參數，設定葉室面積1.7 cm2，光強[1 200 μmol?(m2?s)?1]；相對葉綠素(soil and plant analyzer develotrnent, SPAD)值采用TYS-3N 型植物營養測定儀測定；SOD、POD、CAT 活性分別采用氮藍四唑(nitroblue tetrazolium, NBT)光還原法、愈創木酚-分光光度法和紫外吸收法測定[17]。測定結束后，取剩余幼苗地上和地下部分用液氮速凍于? 80 ℃冰箱中。

1.3 轉錄組測序分析

將保存于-80 ℃冰箱中的幼苗樣本做好標記，委托杭州景杰生物科技有限公司利用Illumina HiSeq 2000 測序平臺進行轉錄組高通量測序分析。去除原始數據中含有接頭和低質量的序列，并根據堿基質量值進行修剪，得到clean reads。與甘草參考基因組進行比對后，使用RPKM (Reads Per Kilobase per Million mapped reads)法對reads counts 進行均一化處理，進而評估基因的表達量。差異表達基因(differentially expressed genes, DEGs)的篩選標準為P< 0.05、|log2FC| > 1。同時對篩選得到的DEGs 進行基因本體(gene ontology, GO)功能注釋和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)代謝途徑分析。利用美國國家生物技術信息中心(National Coalition Building Institute,NCBI)網站Blastp 在線工具，對差異表達倍數最高的前10 個DEGs 進行比對分析，并根據結果進行功能注釋。

1.4 轉錄調控網絡預測分析

根據基因注釋信息，分別從甘草地上和地下部分的DEGs 中篩選出次級代謝產物合成相關基因，并利用植物轉錄調控預測網站(http://plantregmap.cbi.pku.edu.cn/)鑒定DEGs 中潛在的轉錄因子，對鑒定的轉錄因子與次級代謝相關基因的轉錄調控關系進行預測。

1.5 數據處理

使用Excel 2013 進行數據統計與整理，利用SPSS 21 對生理指標進行方差分析和顯著性檢驗，并使用Origin 2017 繪圖，采用Cytoscape 3.7.1 軟件繪制轉錄調控網絡圖。

2 結果與分析

2.1 干旱脅迫對甘草光合生理特性的影響

2.1.1 光合參數變化

正常供水條件下，甘草的Pn為9.55 μmol?(m2?s)?1，隨著干旱脅迫時間的延長，甘草的Pn呈持續降低趨勢，脅迫處理7 d 時降到最低[0.56 μmol?(m2?s)?1]，顯著低于其他處理時間(P< 0.05) (圖1)。甘草的Ci變化波動較大，在干旱脅迫1 d 時，降到最低(208.38 μmol?mol?1)，至干旱脅迫7 d 時，Ci上升并達到最大(304.00 μmol?mol?1)。甘草的Gs在處理7 d 時降到最低，顯著低于其他處理時間，僅為正常供水組的10%。甘草的Tr變化趨勢同Gs相一致，在處理結束時降至最低[0.28 mmol?(m2?s)?1]。

圖1 干旱脅迫對甘草光合參數的影響Figure 1 Effects of drought stress on the photosynthetic parameters of Glycyrrhiza uralensis

2.1.2 相對葉綠素含量變化

甘草SPAD 值在干旱脅迫1 d 時顯著上升(P<0.05)，達到最大(39.72)，之后趨于平穩，干旱脅迫1、3、5 d 時，各處理間無顯著差異(P> 0.05)，至干旱脅迫第7 天時顯著下降至36.58 (圖2)；各脅迫處理均顯著大于正常供水對照。

圖2 干旱脅迫對甘草相對葉綠素含量的影響Figure 2 Effects of drought stress on the relative chlorophyll content of Glycyrrhiza uralensis

2.2 干旱脅迫對甘草葉片和根中CAT、POD、SOD 活性的影響

干旱脅迫1 d 時，甘草葉片中CAT 活性顯著上升并達到最大(P< 0.05)，脅迫3 d 時降低，但之后隨脅迫時間延長呈逐步升高的趨勢；根中的CAT 活性在干旱脅迫1 d 時顯著下降至最低，之后呈現先上升后下降的趨勢，在干旱脅迫7 d 時CAT 活性降低，但與正常供水對照相比無顯著差異(P> 0.05)(圖3)。甘草葉片中的POD 活性在干旱脅迫1 d 時下降至最低值，之后隨著脅迫時間的延長總體呈現逐步升高的趨勢，并在干旱脅迫7 d 時達到最高；根中POD 活性在干旱脅迫7 d 時顯著高于正常供水對照(P< 0.05)，但與干旱脅迫1、5 d 之間無顯著差異(P> 0.05)。甘草葉片中SOD 活性變化平穩，總體呈上升趨勢，在處理3 和7 d 時SOD 活性顯著高于正常供水對照(P< 0.05)；根中SOD 活性總體呈現先上升后下降的趨勢，但與正常供水對照相比，處理1、3、5 d 之間的SOD 活性并無顯著差異(P> 0.05)，至干旱脅迫7 d 時顯著下降(P< 0.05)，為正常供水對照的42.49%。

圖3 干旱脅迫對甘草葉片和根中抗氧化酶活性的影響Figure 3 Effects of drought stress on antioxidant enzyme activities in the leaves and roots of Glycyrrhiza uralensis

2.3 轉錄組測序結果

2.3.1 測序質量結果

將對照組和干旱脅迫處理組甘草地上部分、地下部分進行轉錄組測序，每個樣本設置3 次重復，獲得地上部分3 組對照組的平均clean reads 為43 119 552，Q20大于98.00%，Q30大于95.00%，GC 堿基比例大于45.00%；干旱脅迫組的平均clean reads 為45 638 526，3 組重復處理的Q20大于98.00%，Q30大于94.00%，GC 堿基比例大于46.00%。地下部分3 組對照組的平均clean reads 為43 037 220，Q20大于98.00%，Q30大于94.00%，GC 堿基比例大于46.00%；干旱脅迫組的平均clean reads 為42 059 404，3 組重復處理的Q20大于98.00%，Q30大于94.00%，GC 堿基比例大于47.00%。樣本的測序數據Q30滿足標準，同時GC 含量接近，可以進行后續生物信息分析。

2.3.2 地上部分和地下部分DEGs 表達分析

以|log2FC| > 1、P< 0.05 為DEGs 的篩選標準，與對照組相比，干旱脅迫下甘草地上部分共檢測出7 500 個DEGs，其中上調表達基因數量3 649 個(48.65%)，下調表達基因3 851 個(51.35%) (圖4A)。甘草地下部分共檢測出5 298 個DEGs，其中上調表達基因3 087 個(58.27%)，下調表達基因2 211 個(41.73%) (圖4B)。分別有5 258 (49.81%)和3 056 個(28.95%) DEGs 是甘草地上和地下部分特異性表達的，2 242 個(21.24%) DEGs 是二者共有差異表達的(圖5)。在這2 242 個DEGs 中，共誘導表達283 個(12.62%)，抑制表達407 個(18.15%)，在地上部分和地下部分相反表達1 552 個(69.22%)。

圖4 干旱脅迫下甘草地上部分(A)和地下部分(B)差異表達基因火山圖Figure 4 Volcanic diagram of differentially expressed genes (DEGs) in aboveground part (A) and underground part (B) of Glycyrrhiza uralensis under drought stress

圖5 差異表達基因韋恩圖Figure 5 Venn diagram of differentially expressed genes (DEGs)

2.3.3 差異表達基因的GO 分類和顯著性富集分析

為探究干旱脅迫下甘草響應基因的功能，對轉錄組數據進行GO 功能富集分析，發現甘草地上和地下部分分別有6 008 和4 117 個DEGs 在GO 數據庫中得到注釋，其中地上部分的DEGs 分布于生物過程、細胞組分、分子功能三大類的52 個亞類中，地下部分的DEGs 分布于三大類的50 個亞類中。地上和地下兩部分的DEGs 在三大類的分布基本一致，均被顯著富集到細胞過程、代謝過程、單一生物過程、刺激響應、細胞、細胞部分、細胞器、膜、結合、催化活性、轉導活性等類別(圖6)。

圖6 差異表達基因基因本體富集分析Figure 6 Gene ontology (GO) enrichment analysis of the differentially expressed genes (DEGs)

通過Blastp 篩選出上調和下調基因中表達顯著的DEGs (表1)，比對分析發現甘草地上部分參與干旱脅迫應答的基因主要有具有SOD 活性的胚樣蛋白(可能的)基因(Glyur000570s00022984)、在植物防御反應中產生最多的蛋白之一致病相關蛋白1 基因(Glyur000270s00013309)、具有氧化還原活性的小檗堿橋酶8 基因(Glyur000005s00001103)、非生物脅迫反應相關的FAR1 相關序列(Glyur000132s00015956)和UPF0481 蛋白相關基因(Glyur000936s00037090)、與植物激素和次生代謝具有密切關系的UDP-糖基轉移酶88B1 基因(Glyur001034s00029013)以及控制胞漿離子濃度的陽離子/ H + 反向轉運蛋白基因(Glyur000160s00019165)等。地下部分參與干旱脅迫應答的基因主要是增強蛋白質多樣性的U1 小核核糖核蛋白A 基因(Glyur002700s00036100)、調節細胞分裂分化的ADP-核糖聚合酶基因RCD1(Glyur000341 s00020158)、能夠在細胞表面識別病原體和激活細胞內防御信號的抗病蛋白RPP8基因(Glyur005334s00 043878)、調節茉莉酸激素信號的細胞色素P450 94B3基因(Glyur001736s00033407)以及控制植物生長發育過程的同源基因SBH1(Glyur000259s00016757)等。

表1 樣品中差異倍數前10 名基因Table 1 Top 10 genes with multi-fold differentiation in the specimens

2.3.4 差異表達基因的KEGG 途徑富集分析

為研究參與干旱脅迫響應的DEGs 生物學行為，對其進行了KEGG 代謝途徑分析，將P≤0.05 的通路定義為DEGs 顯著富集的通路。地上部分共有2 094 個DEGs 注釋到KEGG 代謝途徑中，其中最顯著富集的通路為轉運蛋白(transporters)，共有196 個DEGs，上調117 個，下調79 個；其次為轉錄因子(transcription factors)，共有139 個DEGs，上調68 個，下調71 個；再次為蛋白激酶(protein kinases)，共有83 個DEGs，上調17 個，下調66 個(表2)。其他通路主要涉及生物合成，如苯丙烷類生物合成(phenylpropanoid biosynthesis)、類黃酮生物合成(flavonoid biosynthesis)等；代謝途徑如淀粉和蔗糖代謝(starch and sucrose metabolism)、牛磺酸和亞牛磺酸代謝(taurine and hypotaurine metabolism)。甘草地下部分共385 個DEGs 注釋到KEGG 代謝途徑中，其中最富集通路為轉錄因子，共124 個DEGs，上調表達80 個，下調表達44 個；其次為蛋白激酶，共57 個DEGs，上調表達47 個，下調表達10 個；再次為植物激素信號轉導(plant hormone signal transduction，上調表達32 個，下調表達23個。其余代謝途徑包括甘草根中有效成分相關的代謝途徑苯丙烷類生物合成以及二萜類生物合成(diterpenoid biosynthesis)。進一步分析相關代謝途徑之后發現保護酶系統重要成分谷胱甘肽代謝酶、過氧化物酶、抗壞血酸氧化酶相關基因在甘草地上、地下部分均有顯著響應，其中尤以谷胱甘肽代謝酶為主，分別有6 和8 個相關DEGs 在干旱脅迫下顯著上調。

表2 差異表達基因顯著富集的京都基因與基因組百科全書代謝途徑Table 2 Significantly enriched Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathways of differentially expressed genes (DEGs)

2.3.5 干旱脅迫對甘草次級代謝相關基因表達的影響

對甘草轉錄組中的DEGs 分析發現，干旱脅迫影響了甘草萜類、黃酮類等次級代謝產物合成途徑中相關基因的表達(表3)。包括萜類生物合成的關鍵酶1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶、1-脫氧-D-葡萄糖-5-磷酶還原異構酶、11-氧-β-淀粉酶30 氧化酶；黃酮類生物合成限速酶查爾酮合酶、查爾酮異構酶等。相關基因在地上部分上調表達28，下調表達17 個，在地下部分上調表達15 個，下調表達6 個，表明適度干旱脅迫促進了甘草次級代謝途徑基因的表達。

表3 甘草中受干旱脅迫調控的次級代謝相關基因Table 3 Secondary metabolism-related genes regulated by drought stress in Glycyrrhiza uralensis

2.3.6 干旱脅迫下轉錄調控網絡分析

轉錄因子在植物響應逆境脅迫中扮演著重要角色。在轉錄組數據中，地上和地下部分總共有264和226 個DEGs 被鑒定為轉錄因子，并分別屬于32和34 個轉錄因子家族。兩個組織部位中差異表達較多的轉錄因子類型主要是ERF (ethylene responsive transcription factors)、bHLH、C2H2 (C2H2-zinc-finger protein transcription factor)、Dof (DNA binding with one finger)、bZIP (basic leucine zipper)、MYB_related 等，其中ERF 的DEGs 數目最多(圖7)。地上部分WRKY、NAC (NAM/ATAF/CUC)、 TCP (teosinte branched I/Cycloidea/proliferating cell factor)等DEGs 的數量幾乎是地下部分的2 倍，地下部分中bHLH、MYB_related以及LBD (lateral organ boundaries domain)的DEGs 數目高于地上部分。在地上和地下部分中，有95 個共同差異表達的基因被鑒定為轉錄因子，分別有169和131 個特異性表達的轉錄因子，如EIL (ethylene insensitive3-like)、VOZ (vascular plant one-zinc-finger)、BES1 (BRI1-ethylmethylsulfone-suppressor 1)等在地上部分特異性表達，而在地下部分特異性表達的轉錄因子有RAV (related to ABI3/VP1)、WOX (WUSCHELrelated homeobox)以及SRS (SHI-related sequence)等。

圖7 干旱脅迫下差異表達轉錄因子Figure 7 Differentially expressed transcription factors in Glycyrrhiza uralensis under drought stress

利用轉錄調控關系預測網站，對甘草次級代謝產物合成相關基因與差異表達轉錄因子之間的調控關系進行了預測分析，結果發現地上和地下部分分別有19 和14 個差異表達的轉錄因子與次級代謝產物合成相關基因存在共表達網絡。根據轉錄因子家族分類，地上部分包括ERF(AT5G25390、AT2G 40340、AT5G67190、AT3G23240)、TCP (AT3G47620、AT1G53230、AT3G02150 )、MYB (AT1G79180、AT4G 38620、AT5G14340)、bHLH (AT2G22750)、bZIP (AT3G 30530)、NAC (AT1G71930)等轉錄因子(圖8A)。地下部分則是MYB (AT5G10280、AT5G08520、AT4G 38620)、C2H2 (AT5G04390)、TCP (AT3G47620、AT5G 51910)、bZIP (AT3G30530、AT3G62420)、WRKY (AT5G 52830、AT5G13080)等轉錄因子(圖8B)。

圖8 甘草地上部分(A)和地下部分(B)次級代謝途徑相關基因的轉錄調控網絡Figure 8 Transcriptional regulatory network of genes related to secondary metabolic pathway in the aboveground part (A) and underground part (B) of Glycyrrhiza uralensis

3 討論與結論

干旱脅迫會抑制植物光合作用的進行，嚴重影響植株的正常生長發育。幾乎所有的植物在遭受干旱脅迫時的第一反應都是關閉氣孔以防止水分蒸發[18]。有研究認為，由于氣孔的關閉和葉肉細胞光合能力的降低，導致干旱脅迫下大豆(Glycine max)的Pn、Gs降低，Ci升高[19]。經轉錄組分析發現9-順式環氧類胡蘿卜素雙加氧酶(NCED)基因在地上部分顯著上調，有研究表明NCED基因受干旱脅迫誘導，在過表達的轉基因植物中會上調內源ABA 水平[20]。ABA 在植物抵御干旱脅迫的機制中作為一種化學信號，通過誘導氣孔關閉從而保存水分。此外，干旱脅迫下葉片的衰老加速了光合色素的降解，這也導致了Pn的下降[13]。在本研究中觀察到SPAD 值在不同干旱脅迫時間下呈現先上升后下降的趨勢，干旱脅迫初期SPAD 值的增加可能是由于植物生長速率降低引起的集中效應[21]，隨著脅迫持續時間的延長最終導致SPAD 值下降。以上結果表明，甘草Pn下降可能是由于氣孔關閉以及葉綠素含量的降低共同導致的。

光合能力的下降可能會降低光合電子的傳遞速率，這有利于電子流向分子氧，從而導致植物產生超氧自由基，打破植物體內ROS 的平衡[21]。干旱等非生物脅迫破壞植物細胞的代謝平衡，導致ROS 的含量增高，植物可以感知和評估體內ROS 的水平，并調控相應的基因表達，使ROS 和保護酶活性之間存在動態平衡以響應干旱脅迫。轉錄組分析結果顯示，干旱脅迫對甘草地上和地下部分的多種保護酶基因均具有雙向調控作用，尤以谷胱甘肽代謝酶相關DEGs 表達最為顯著。谷胱甘肽代謝酶不僅是一種重要的ROS 清除劑，還發揮各種內源和外源物質的解毒作用[7,22]。本研究中也觀察到干旱脅迫結束時，甘草葉片中SOD 活性顯著增加，而根中CAT 活性無顯著差異，POD 活性顯著上升，SOD活性顯著降低。CAT 和POD 是清除H2O2分子的主要酶類[23]。CAT 主要負責分解H2O2，并與SOD 協同清除超氧自由基，而POD 則具有雙重作用，在清除H2O2的同時，將初期的過氧化物氧化為丙二醛，以便于保護酶將其徹底清除[24]。甘草葉片和根中3 種保護酶對水分虧缺的響應不一致，表明在植物不同器官中，起保護作用的酶可能不同，不同器官對同一脅迫的反應也有差異。

眾多研究表明，轉錄組測序技術能從mRNA 水平全面地反映物種基因功能及特定的生物學過程，利用轉錄組測序技術研究干旱脅迫下植物的基因表達水平，有利于揭示植物的抗旱應答機理[25]。本研究對干旱脅迫下甘草地上和地下部分轉錄組進行了測序和DEGs 表達分析，結果發現，兩種組織中分別檢測出7 500 和5 298 個DEGs，其中共有2 242個DEGs 差異表達，1 552 個DEGs 相反表達。這些結果表明，甘草地上部分對干旱脅迫的響應比地下部分更敏感，并且在響應干旱脅迫過程中兩種組織可能具有不同的發育軌跡，但功能注釋發現，地上和地下部分DEGs 在GO 功能部位中的分布基本一致，這與干旱脅迫下豌豆(Pisum sativum)轉錄組分析結果相似[12]。在分析顯著表達的DEGs 時，發現甘草地上、地下部分顯著表達的DEGs 主要涉及到植物防御、抗氧化酶活性、植物激素、植物生長發育等生物過程，這表明甘草可能主要通過這些生物過程抵御干旱脅迫。對地上、地下兩部分中DEGs 的KEGG 途徑分析表明，干旱脅迫促進逆境防御基因的表達，并且二者均在轉錄因子、蛋白激酶、細胞色素P450 等代謝途徑中顯著富集。有研究結果表明在適度干旱脅迫下，甘草有效成分合成相關的途徑中，一些關鍵酶基因在甘草根中上調表達[26]，這與本研究結果類似，DEGs 在有效成分合成途徑中得到了顯著富集并明顯上調表達，這可能是干旱脅迫促進甘草活性成分積累的基礎。

轉錄因子是許多脅迫響應基因的主要調控因子，可以增強植物對非生物脅迫的耐受性。本研究結果表明干旱脅迫可以調控甘草多種轉錄因子的表達，其中ERF、bHLH、C2H2、MYB、TCP、WRKY等在地上和地下部分表達均較顯著。已有研究證實包括bZIP、AP2 / ERF(APETALA2/ethylene-responsive element binding factors)、NAC、bHLH、WRKY 和MYB等在內的多個轉錄因子家族參與干旱脅迫響應[27-28]。其中，鑒定的差異表達轉錄因子數目最多的屬于AP2 /ERF 家族，有近85%的ERF 家族成員在地下部分中上調表達，75%的ERF 家族成員在地上部分中上調表達。有研究表明，ERF 轉錄因子可以作為正向調節劑，參與大豆逆境脅迫響應基因的表達，從而提高植株的耐旱性[28]。另一類差異表達數目較多的轉錄因子為MYB 家族。研究證實擬南芥(Arabidopsis thaliana)中的AtMYB2作為ABA 信號的主要轉錄激活因子，在干旱脅迫下發揮重要作用[29]。在本研究結果中，有1 個共同表達的DEGs(Glyur000144s00012217)被鑒定為MYB2 轉錄因子，且在地上和地下部分中均被顯著上調，這表明MYB2 轉錄因子可能正向調節甘草干旱脅迫響應。此外，C2H2、Dof 等鋅指轉錄因子在植物的發育以及抵抗非生物脅迫中同樣也具有重要意義[30]。不僅如此，轉錄因子還廣泛參與中藥次生代謝產物合成基因的調控[31]。目前已成功分離、鑒定了多個調控藥用植物次級代謝產物合成的WRKY、MYB、ERF、bHLH 類轉錄因子[32]。本研究結果中，干旱脅迫下，ERF、bHLH、NAC、MYB、WRKY 等轉錄因子在甘草地上和地下部分中均表現出誘導型表達，并與差異表達的次級代謝相關基因形成共表達網絡，表明它們在干旱脅迫下參與調控甘草干旱脅迫應答機制，可能是促進干旱脅迫下甘草有效成分合成的調節因子。

綜上所述，干旱會導致甘草Pn、Tr和Gs降低。葉片和根部通過誘導保護酶基因的表達以調節抗氧化酶活性的方式來清除ROS。干旱誘導了ERF、bHLH、NAC、MYB、WRKY 等轉錄因子的表達，影響了次級代謝產物的合成途徑，為進一步在分子水平上深入研究提高甘草抗旱性及發掘相關耐旱基因提供了參考資料。