梓醇對高糖誘導SH-SY5Y細胞凋亡的Bcl-2蛋白和 YAP蛋白的影響

韓飛飛，劉亞群，廖晶，田美嬌，王一林，李宗澤

(錦州醫科大學，遼寧 錦州 121000)

2010年，全世界估計有2.85億人患有糖尿病，預計到2030年，這一數字將增加到4.39億[1]。糖尿病腦病(diabetic encephalopathy，DE)是糖尿病的主要并發癥，其主要特征是神經組織結構和化學物質組成的異常，并伴有認知功能障礙[2]。DE給患者的家庭帶來了巨大的痛苦，令患者的生活質量嚴重下降，然而遺憾的是，時至今日，DE發病的詳細機制仍不清楚。

高血糖狀態下引起的機體氧化損傷導致的神經細胞凋亡被認為是糖尿病腦病發生的重要原因之一，Nan F的研究指出，甲基乙二醛是高血糖癥的高反應性代謝產物，也是糖基化終產物的主要前體，可以誘導SH-SY5Y細胞的氧化應激和凋亡[3]。Dolors Puigoriol在高脂膳食誘導的糖尿病小鼠模型體內，氧化應激(oxidative stress，OS) 和活性氧(reactive oxygen species，ROS)的水平明顯升高[4]。雖然大量臨床研究指出，氧化應激、神經元細胞凋亡、DE間存在著相關性，但具體涉及到的信號通路仍不甚明了。

HiPPO信號通路最早在果蠅體內被發現，屬于一種抑制性信號通路。機體可以通過該信號通路的核心成分對細胞的增殖、分化和凋亡進行調節[5]。Fan Yu的研究指出，在糖尿病腦病小鼠模型體內，存在Hippo信號通路的異常，改善Hippo信號通路的轉導異常，可能有助于DE的治療[6]。轉錄輔激活因子Yes-相關蛋白(yes-associated protein，YAP)是Hippo通路的下游效應分子，Bcl-2蛋白是Hippo信號通路的調節因子之一。Gun Woo Won的研究發現，抗凋亡蛋白Bcl-2可以通過與Hippo信號通路中的關鍵蛋白哺乳動物ste20-like激酶(mammalian ste20-like kinases，MST1/2)和支架蛋白Salvador-1(SAV1)的直接作用來調節Hippo信號通路所致的細胞凋亡[7]。

梓醇是我國傳統中藥地黃的主要成分，具有很強的抗氧化能力，Liu S的研究認為，梓醇能夠有效改善鏈脲佐霉素(streptozocin,STZ)誘導的SH-SY5Y細胞的凋亡，是一種很好的神經保護劑[8]。I-Cheng Chen 的實驗發現，梓醇在脊髓小腦的共濟失調模型中具有很強的抗氧化損傷作用[9]。我們之前的研究也驗證了梓醇可以明顯改善高糖導致的SH-SY5Y細胞的凋亡，但是詳細機制并未探討[10]。

本研究擬采用高糖誘導SH-SY5Y細胞凋亡模擬糖尿病腦病狀態下的神經元凋亡模型，選用梓醇作為保護藥物，探討其抗凋亡作用機制是否與Bcl-2蛋白和YAP蛋白有關。

1 資料與方法

1.1 一般資料

梓醇購自購自中國藥品生物制品檢定所(純度≥98%)；CCK-8試劑盒(美國Glpbio公司)；D-無水葡萄糖、胰蛋白酶-EDT消化液、胎牛血清、AnnexinV Alexa Fluor488/PI凋亡檢測試劑盒、活性氧檢測試劑盒(北京索萊寶生物科技有限公司)；DMEM低糖培養基(美國Themro Fisher公司)。兔抗人YAP1多克隆抗體、小鼠抗人Actin單克隆抗體、山羊抗兔IgG抗體、山羊抗鼠IgG抗體(美國Themro Fisher公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與分組

人神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞購自北京協和醫學院基礎醫學院。SH-SY5Y細胞采用含有10%胎牛血清的低糖DMEM培養液，添加青霉素100 Ku/L和鏈霉素100 mg/L，置于恒溫37 ℃、5%二氧化碳培養箱中培養。細胞分為正常對照組：用低糖DMEM培養48 h；高糖組：用含葡萄糖80 mmol/L的DMEM培養液培養48 h；梓醇保護組：用含葡萄糖80 mmol/L+梓醇0.5、1、2 mg/mL的DMEM培養液培養48 h。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞活力

取對數生長期的細胞，調整細胞密度至105個/mL接種在96孔板中，每孔100 μL，于細胞培養箱中37 ℃培養24 h。細胞貼壁后，按照1.2.1的處理方法培養細胞。培養結束后，每孔加入10 μL CCK8溶液，放入培養箱中孵育2 h。酶標儀450 nm處測量吸光度值(A值)[11]。

1.2.3 DCFH-DA探針法檢測活性氧含量

按照 1∶1000 用無血清培養液稀釋 DCFH-DA，使終濃度為 10 μmol/L。收集按照1.2.1的處理方法培養的各組細胞后，懸浮于稀釋好的DCFH-DA中，調節細胞濃度至107個/毫升，于細胞培養箱內37 ℃孵育20 min。每隔3 min顛倒混勻一下，使探針和細胞充分接觸。使用 488 nm 激發波長，525 nm 發射波長的熒光酶標儀檢測各組細胞內的熒光強度[12]。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡率

按照1.2.1的處理方法培養處理各組細胞結束后，加入1 mL 4 ℃預冷的PBS重懸細胞，離心后沉淀細胞。用結合緩沖液重新懸浮細胞，調節其濃度為2×106個/毫升，取100 μL的細胞懸液于5 mL流式管中，加入5 μL Annexin V/Alexa Fluor 488混勻后于室溫避光孵育5 min，加入10 μL 20 μg/mL 的碘化丙錠溶液(PI)，并加400 μL PBS溶液，立刻進行流式檢測[13]。

1.2.5 Western blot法檢測蛋白質的含量

取對數生長期的細胞，按照2×105個/孔接種于細胞培養皿中，根據1.2.1的處理方法培養細胞。培養結束后，收集細胞，加入細胞裂解液，提取細胞總蛋白，經 10% SDS-PAGE 凝膠電泳分離，冰浴轉移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，用YAP的一抗(1∶1000)4 ℃孵育過夜，PBST洗3次，每次10 min，分別加入對應的二抗(1∶5000)室溫孵育2 h，PBST洗3次，每次10 min。內參選用Actin。采用化學發光法顯影，通過凝膠成像儀采集圖片，蛋白表達水平采用AlphaView SA軟件分析蛋白表達情況[14]。

1.3 統計學方法

采用SPSS 23.0統計軟件進行描述性分析與方差分析，實驗數據采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 CCK-8法檢測細胞活力

與正常對照組相比，高糖對細胞增殖有明顯的抑制作用(P<0.05)。不同濃度的梓醇對高糖的抑制增殖作用有明顯的改善(P<0.05)，見表1。

表1 梓醇對高糖作用SH-SY5Y細胞增值率的影響

2.2 DCFH-DA探針法檢測活性氧含量

與正常對照組相比，高糖組ROS含量明顯升高(P<0.05)。不同濃度的梓醇保護組細內ROS含量明顯減少(P<0.05)，并呈劑量依賴性，見表2。

表2 梓醇對高糖作用SH-SY5Y細胞內ROS含量的影響

2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡率

與正常對照組相比，高糖組細胞的早期凋亡率明顯升高(P<0.05)。與高糖組相比，梓醇保護組細胞的早期凋亡率明顯降低(P<0.05)，并呈劑量依賴性，見表3，圖1。

表3 梓醇對高糖作用SH-SY5Y細胞凋亡率的影響

A:正常對照組；B:高糖組；C:梓醇0.5 mg/mL組；D:梓醇1 mg/mL組；E:梓醇2 mg/mL組

2.4 Western blot法檢測YAP、Bcl-2蛋白質的含量

與正常對照組相比，高糖組YAP蛋白，Bcl-2蛋白含量明顯下降(P<0.05)，與高糖組相比，梓醇保護組細胞YAP蛋白，Bcl-2蛋白含量明顯升高(P<0.05)，結果見表4、圖2。

表4 Western blot法檢測YAP、Bcl-2蛋白質的含量

3 討 論

糖尿病并發癥(糖尿病腎病、足潰瘍、視網膜病變等)和合并癥(糖尿病合并腫瘤、糖尿病合并脂肪肝等)是糖尿病患者致殘、致死的首要原因。高血糖引發并發癥/合并癥的原因眾多，如多元醇通路、蛋白激酶C、糖基化終末產物、炎癥等，但究其上游均與氧化應激/活性氧自由基(ROS)的過度生成有關。Huang等人的研究指出，在糖尿病大鼠模型體內，存在丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)的異常升高[15]。本研究發現，高糖組的細胞內ROS水平達到了(292.16±9.21)%，而細胞凋亡率則為(40.77±1.98)%，與正常組相比均明顯升高(P<0.05)，提示高糖狀態下的SH-SY5Y細胞凋亡很可能與氧化應激損傷有關。梓醇作為傳統中藥地黃的主要有效成分之一具有很強的抗氧化能力，Yang等人的研究發現，梓醇可以明顯改善H2O2誘導的原代皮層神經細胞的凋亡，并降低神經元細胞內的MDA和ROS水平[16]。本研究發現，低、中、高濃度梓醇保護組的ROS水平分別為(213.87±8.03)%、(188.43±8.76)%、(127.91±7.65)%，與高糖組相比均明顯下降(P<0.05)，并呈劑量依賴性，提示梓醇可以有效改善高糖所致的SH-SY5Y細胞的氧化損傷。而低、中、高濃度梓醇保護組的細胞存活率分別為(35.3±2.13)%、(24.57±1.16)%、(19.69±3.07)%，與高糖組相比均明顯下降(P<0.05)，并呈劑量依賴性，提示梓醇可以對抗高糖所致的SH-SY5Y細胞凋亡。

Hippo信號通路可以被物理、化學以及病理生理狀態等多種類型的信號所調節，Peng的研究指出，高糖可以通過氨基己糖通路令Hippo通路中的關鍵效應分子發生糖基化的修飾從而激活其轉錄活性[17]。轉錄輔激活因子Yes-相關蛋白和帶有PDZ結合基序的轉錄輔助激活物是Hippo通路的下游效應分子，Bcl-2蛋白是Hippo信號通路的調節因子之一。但同時，Gun Woo Won的研究發現，Bcl-2也可以通過與Hippo信號通路中的MST1/2和SAV1的直接作用來調節Hippo信號通路對抗細胞凋亡。本研究中Western blot的結果顯示，在梓醇保護組中Bcl-2蛋白、YAP蛋白的表達與高糖組相比均有所提高(P<0.05)，這說明梓醇可能是通過上調抗凋亡蛋白Bcl-2的含量來調節Hippo信號通路中的關鍵蛋白YAP的含量實現減輕高糖所致的SH-SY5Y的細胞凋亡，但是這種抗凋亡作用的詳細分子機制還需要進一步的研究。