基于CRISPR-Cas9構建樹突狀細胞相關C型凝集素-1基因敲除小鼠模型

陳 潔 謝葉文 潘 潔 丁 駿

江蘇省常州市第二人民醫院中心實驗室，江蘇常州 213000

樹突狀細胞相關性C型凝集素-1（dendritic cellassociated C-type lectin-1，Dectin-1）是屬于ⅡC 型凝集素受體 （C-type lectin receptors，CLR） 家族成員之一，由CLEC7a基因編輯。主要表達于巨噬細胞、樹突狀細胞、中性粒細胞等多種細胞表面[1]，同時在肺、胸腺等多個器官中也高表達，其主要作用是模式識別受體，Dectin-1可通過識別CD4+、CD8+T細胞表面的內源性受體，從而促進T細胞的增值[2]，Dectin-1在免疫預防與免疫監視中均起到重要的作用。

樹突狀細胞（dendritic cell，DC）是機體功能最強的抗原遞呈細胞（antigen-presenting Cell，APC），現已被應用到多種腫瘤治療中[3]。Dectin-1是最早發現在DC 上的模型識別受體，Dectin-1 可以識別 β-（1，3）-葡聚糖與其結合刺激樹突狀細胞誘導Th1和Th17細胞分化[4-5]，啟動機體的獲得性免疫，同時也能通過識別真菌細胞壁上的β-葡聚糖，驅動宿主細胞對真菌吞噬和黏附，并以這種方式開啟機體的天然免疫。這明確了Dectin-1在腫瘤免疫中的機制，同時也是把Dectin-1作為腫瘤免疫治療的新靶點的依據。

CRISPR-Cas9是古細菌和細菌在演化過程中產生的一種適應性免疫防御[6]，其作用是抵御外界侵入細菌的DNA或外源DNA，CRISPR-Cas9基因編輯系統是基因敲入技術中最高效的一種方法，其能夠準確識別外來的DNA，并將其雙鏈進行特異性切割，應用CRISPR-Cas9系統，通過設計靶向目的基因的sgRNA實現Cas9蛋白對DNA雙鏈的特異性切割。哺乳動物中，DNA雙鏈斷裂后會發生非同源末端連接介導的非同源末端連接修復，DNA雙鏈在重新連接的同時引入隨機的堿基缺失或增加，造成基因序列移碼突變，蛋白功能缺失（圖1，封三）[7-9]。本研究通過CRISPRCas9技術敲除小鼠體內Dectin-1基因，進一步研究Dectin-1對β-葡聚糖抗腫瘤的影響，為Dectin-1在腫瘤免疫中的作用機制研究提供實驗基礎。

圖1 CRISPR-Cas9基因編輯技術圖（見內文第41頁）

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 3～4周齡的C57BL/6野生型小鼠；購買于常州卡文斯實驗動物有限公司[SCXK（蘇）2016-0010]，并飼養于此公司。飼養環境為SPF級，濕度（55±10）%，溫度（22±4）℃，飼養 1 周。

1.1.2 實驗試劑及儀器 二甲基亞砜（fimethyl sulfoxide，DMSO），來自sigma 公司（D2650）；mMESSAGE mMA CHINE T7 kit（AM1344）和 MEGAclear kit（AM1908）均購自Life Technologies公司；QIAQuick PCR純化試劑盒購自 Qiagen 公司（28104）；T7-Cas9（39994）和T7-sgRNA（68463）均購自Addgene公司；人絨毛促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG），KSOM，血清促性腺激素（pregnant mare serum gonadotropin，PMSG）。SZX7 立體顯微鏡（Olympus，SZX7），二氧化碳培養箱（英國 Thermo，3111）和倒置熒光顯微鏡（Olympus，IX71）。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 從NCBI基因組查詢數據得到C57BL/6野生型小鼠的Clec7a基因總長為11189bp，在6號染色體上有6個外顯子，在外顯子2的功能區前端和后端分別設計兩對引物，上游引物和下游引物見表1。

1.2.2 Cas9 mRNA及sgRNA的體外轉錄和純化 引物序列通過PCR進行擴增，將T7啟動序列添加到Cas9的編輯區域中（表1）。用TEA緩沖液配置1%的瓊脂糖凝膠，進行PCR實驗用來檢測T7-Cas的特異性和長度（T7-Cas大小約為4.3 kB）。使用QIAQuick PCR純化試劑盒，對T7-Cas9 PCR產物進行純化。使用mMESSAGE mMACHINE T7試劑盒，把純化后的產物作為模板，進行Cas9mRNA體外轉錄。使用MEGA-clear試劑盒，用50 μl洗脫緩沖液進行洗脫，根據試劑盒操作步驟對Cas9 mRNA進行純化。純化后，用無RNase的水將Cas9 mRNA稀釋至500 ng/μl，并用TEA緩沖液配置2%的瓊脂糖凝膠，進行質量檢測。

引物通過PCR進行擴增，將T7啟動序列添加到sgRNA的模板中。用TEA緩沖液配置2%的瓊脂糖凝膠，進行PCR實驗用來檢測sgRNA的特異性和長度，PCR檢測其長度為100 pb。使用QIAQuick PCR純化試劑盒，根據其操作步驟，對T7-sgRNA PCR產物進行純化。

1.2.3 受精卵準備 選取12～15只（3～4周齡）的C57BL/6小鼠，在第1天給小鼠注射PMSG，劑量為5 U，48 h后向C57BL/6雌小鼠腹腔注射HCG，劑量為每只5 U。HCG注射之后將雌性小鼠與C57BL/6雄性小鼠過夜。在第4天，收集帶有栓的雌性小鼠，并將沒有栓的雌性小鼠實施安樂死，進行受精卵制備。HCG注射后20～21 h，對見栓的雌性小鼠實施安樂死，從輸卵管處收集卵丘細胞復合體。將卵丘細胞復合體移入HTF+Hy培養基中，然后在HTF培養基中洗滌幾次后將胚胎置于KSOM培養基（加礦物油覆蓋）中，放置37℃，5%CO2的培養箱中培養。將受精卵轉移至HTF+CB培養基中，放置于顯微鏡下用顯微注射針向原核胚胎內注射混合物[注射混合：Cas9（50 ng/μl）+sgRNA（50 ng/μl）+ssDNA（100 ng/μl）；混合液成分：加入 0.5 μl Cas9、0.5 μl sgRNA、0.5 μl ssDNA 以及0.5 μl無核酸酶水；目的：使HDR點突變]。觀察細胞質是否腫脹，腫脹證明注射成功，將胚胎繼續培養24 h至產生2個細胞胚胎。

1.2.4 胚胎移植及Dectin-1小鼠的獲得 注射當天將發情的ICR雌性小鼠和結扎的雄性小鼠交配來準備假孕代孕母鼠。隔天選擇見栓0.5 d的雌鼠，將胚胎移植到代孕母鼠的輸卵管中，或者交配后2.5 d之后將胚胎直接移植到代孕母鼠的子宮內，代孕母鼠在交配19.5 d之后生下F0小鼠。出生后3周，將雌性F0小鼠和雄性F0小鼠分籠飼養。

1.2.5 體內實驗及分組情況 構建野生型小鼠及Dectin-1敲基因小鼠的乳腺癌模型，待皮下腫瘤可觸及時，給予口服β-葡聚糖（beta-gulcan）治療并分為野生型小鼠組、野生小鼠+beta-gulcan組、Dectin-1敲基因小鼠組、Dectin-1敲基因小鼠+beta-gulcan組。首次治療時開始測量腫瘤大小，每2天測量1次，并繪制腫瘤生長曲線，待腫瘤達到規定大小體積時（最長直徑不大于15 mm），處死小鼠。

1.3 觀察指標及評價標準

剪取出生后三周的小鼠尾巴0.5～1 cm并編號，并將其剪碎放置1.5或2 ml的離心管中。加入試劑對樣本進行酶解反應，離心吸取上清液，獲得小鼠的基因組DNA。用PCR技術對基因敲除情況進行驗證，驗證序列見表2，PCR擴增體系見表3，PCR反應條件為95℃，預變性 5 min；按照循環程序（95℃ 30 s；58℃30 s；72℃ 30 s） 進行 40 個循環，72℃延伸 5 min，根據說明書使用QIAQuick PCR試劑盒純化PCR產物。使用TA Cloning試劑盒來測試序列驗證突變。將成功敲除Dectin-1基因的雌性和雄性小鼠進行交配獲得下代小鼠，對下代小鼠進行基因鑒定，刪選繼續交配直到F3代小鼠，用PCR技術對F3代小鼠進行基因鑒定，驗證序列見表4，以確定建立Dectin-1敲除小鼠。

表2 基因引物序列

表3 PCR擴增體系

1.4 統計學方法

采用Graph prism 8.0軟件進行數據分析，兩組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 F0代小鼠獲得

本研究通過顯微鏡操作向原核胚胎內注射混合物，成功種植的胚胎移植到代孕母鼠體內，代孕母鼠在交配19.5 d之后生下F0小鼠。據觀察F0代小鼠狀態良好，外觀與C57BL/6野生型小鼠無差異。

2.2 Dectin-1小鼠基因鑒定結果

DNA測序結果顯示F0代小鼠中Dectin-1基因的部分序列缺失并產生移碼突變（-13bp）（圖2，封四）。通過設計位于移碼缺失區外的引物（P1-P2）和移碼缺失區內的引物（P3-P4），PCR檢測發現，僅P1-P2引物可以擴增出目的條帶（圖3），提示從F3開始，已獲得Dectin-1敲基因小鼠。

圖3 PCR擴增瓊脂糖凝膠電泳結果

2.3 Dectin-1缺失抑制β-葡聚糖誘導的小鼠抗腫瘤能力

本研究構建野生型小鼠及Dectin-1敲基因小鼠的乳腺癌模型，口服β-葡聚糖進行治療，觀察其腫瘤生長情況，結果發現在第14天Dectin-1敲基因小鼠腫瘤體積大于野生型小鼠，差異有統計學意義 （P＜0.05）（圖4，封四）。體內實驗表明Dectin-1缺失可抑制β-葡聚糖誘導的抗腫瘤能力，同時證明Dectin-1敲基因小鼠構建成功。

3 討論

伴隨著分子生物學、免疫學、腫瘤學的不斷發展和相互深入研究，腫瘤免疫治療應運而生[10]。隨著對人體免疫機制研究的不斷深入，腫瘤免疫治療也被越來越多的人所關注[11]，腫瘤免疫治療就是利用再次啟動免疫循環來清除體內沒有被正常免疫系統所識別的腫瘤細胞[12]，來達到清除和控制腫瘤的目的。近幾年，腫瘤免疫治療在非小細胞肺癌、黑色素瘤等多種實體瘤治療中，療效顯著，但是目前腫瘤免疫治療的各種方法還不夠完善。本實驗通過構建免疫相關基因的敲除鼠，研究其在腫瘤免疫中的作用，從而為更多的臨床試驗提供動物模型。

自1973年Siteinman[10]發現DC以來，樹突狀細胞是目前機體中最強的抗原遞呈細胞，而Detin-1是最早在樹突狀細胞上被發現的，目前對于研究樹突狀細胞在腫瘤免疫中的應用和機制，大部分相關研究報道都集中在Dectin-1受體和Dectin-2受體上[4-5]。但由于Dectin-2在樹突狀細胞上并沒有像Dectin-1一樣高表達，所以目前相關研究以Dectin-1為主。有文獻報道發現Dectin-1可以通過不同途徑，激活機體的特異性免疫和非特異性免疫進行腫瘤免疫[12]。因此，本實驗通過構建Dectin-1基因敲除小鼠，研究Dectin-1在抗腫瘤免疫中的作用。

在基因敲除方法中，CRISPR-Cas9技術因其操作簡單、高效率、成本低等優點被科研工作者作為基因編輯的首選方法[13]，在腫瘤免疫治療中也發揮著重要的作用[14-15]。所以本研究利用CRISPR-Cas9技術對小鼠Dectin-1基因進行敲除，經過培養、手術、鑒定獲得F0代小鼠，并通過PCR擴增及測序鑒定的陽性F0代小鼠與C57BL/6J小鼠交配獲得6只陽性F1代小鼠。

β-葡聚糖是一種天然碳水化合物，它主要存在于植物、細菌、真菌的細胞壁上，是Dectin-1的特異性識別受體，Dectin-1通過識別β-葡聚糖，從而誘導免疫受體酪氨基酸活化基序 （immunoreceptor tyrosinebased activation motif，ITAM）激發細胞內的信號轉導，使自身免疫細胞產生一系列的細胞反應，如產生多種炎性因子、趨化因子，這些因子可以促進B細胞、T細胞的體液免疫應答和細胞免疫應答加強[17]，從而增強機體抗腫瘤[18]及抗感染[19-20]能力。本研究通過β-葡聚糖來檢測Dectin-1敲基因小鼠的抗腫瘤能力，結果顯示，Dectin-1敲基因小鼠口服β-葡聚糖后，其抗腫瘤生長能力低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。由此證明Dectin-1敲基因小鼠構建成功，為腫瘤免疫治療臨床試驗提供動物模型，同時有助于臨床更好的研究Dectin-1在腫瘤免疫中的作用機制。

綜上所述，利用CRISPR-Cas9技術構建Dectin-1敲基因小鼠模型建立動物模型有利于腫瘤免疫治療方法的完善，同時對Dectin-1在免疫腫瘤治療中的影響及作用奠定了一定的實驗基礎。