種植體骨結合中生物學過程與分子調控機制的研究進展*

張文靜 王亞楠 徐 欣

近年來，口腔種植技術憑借其無需損傷鄰牙且功能和美學效果好等優點,被越來越多的缺牙患者所接受，是目前一種重要的缺牙修復方式。這種臨床治療的成功在很大程度上依賴于牙槽骨內種植體的穩定結合和維護。種植體骨結合是指在光鏡下觀察，種植體和周圍骨組織緊密接觸，沒有任何纖維組織等非骨組織介入種植體和骨組織之間［1］。良好的骨結合是口腔種植重要的生物學基礎，其受到體內微環境，如多種信號分子和細胞內外基質的影響，并處在骨形成和重塑的動態過程中。通常情況下，種植體植入2h后，即可在傷口腔隙處觀察到由紅細胞，中性粒細胞，單核/巨噬細胞及纖維蛋白等形成的血凝塊；4d后，血凝塊逐漸被肉芽組織取代，肉芽組織中富含由炎癥因子和生長因子募集而來的間充質干細胞及基質成分等；1周后，間充質干細胞數量繼續增多，并在轉錄因子的作用下發生骨特異性基因的轉錄，促進干細胞向成骨細胞分化，與沉積礦化的細胞外基質共同形成編織骨；2-4周時，隨著編織骨數量的增加，它開始逐漸被板層骨所取代，這進一步增強了種植體的穩定性；8-12周時，大部分編織骨被板層骨取代。同時，骨碎片及壞死骨的清除也在發生。因此種植體骨結合是一種動態過程，骨形成和骨重塑共同維持骨穩態的平衡［2］。

有研究［3］指出以大部分編織骨被板層骨替代的事件作為區分種植體骨結合早期和晚期的標志，一般發生在植入種植體后的8-12周。雖然晚期階段具有相對成熟的骨組織并且與種植體表面的接觸度更高，但是種植體骨結合的早期涉及活躍的生物學行為及復雜的分子調控機制，對于種植體初期穩定性起著至關重要的作用，因而受到廣泛關注。目前很多研究嘗試通過調控鈦種植體表面的早期分子生物學反應，進而有針對性地改變種植體的表面形貌以提高種植體骨結合能力［4,5］。深入認知參與骨結合早期階段的分子調控機制對于加速和加強骨結合過程，改善和擴大牙科種植系統的臨床適應征具有重要意義。本研究的目的是對種植體骨結合早期過程中涉及的生物學過程及分子調控機制進行系統性綜述，以期為尋找改善種植體骨結合的分子靶點和擴大種植修復臨床適應征提供良好的理論依據。

1.骨免疫調節機制

鈦及其合金作為外科植入物材料具有良好的生物相容性，目前已廣泛應用在口腔科、骨科、神經外科等。但是在1992年Donath［6］就對鈦的生物惰性現象產生質疑，他認為鈦并非不會引起組織的任何不良反應，反而能夠激發組織內的免疫反應。目前這種觀點已被許多研究者所證實，Trindade等［7-9］認為商業純鈦種植體可以激活機體免疫反應，而骨結合實際是一種異物反應后的組織保護機制，即在鈦種植體周圍形成骨組織來穩定種植體。

研究表明，多種炎癥細胞參與到種植體骨結合早期的免疫調控機制中，包括中性粒細胞、單核-巨噬細胞、淋巴細胞、樹突狀細胞等等。在種植體植入后，血液中的中性粒細胞轉移到種植體表面，由單核-巨噬細胞和上皮細胞分泌的白介素8（interleukin-8，IL-8）激活，進而分泌單核細胞趨化蛋白1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）以及巨噬細胞炎癥因子1β（macrophage inflammatory protein-1β，MIP-1β）兩種細胞因子，以強力激活巨噬細胞、單核細胞、樹突細胞和淋巴細胞產生，從而介導不同的免疫反應。其中由于巨噬細胞高度的可塑性及其在免疫反應中的多重作用，逐漸被越來越多的學者關注［10-12］。

Shanbhag等［3］對早期種植體周圍骨愈合的基因組進行分析，發現與炎癥密切相關的腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）、干擾素（interferon，IFN）家族在種植體植入后3-4d顯著上調，到第7d時，與促炎細胞因子相關的基因白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白介素-1α（interleukin-1α，IL-1α）和有抑炎作用的趨化因子配體18（chemokine (c-c motif) ligand18，CCL18）、趨化因子配體22 (chemokine (c-c motif) ligand 22，CCL22）分別下調和上調［13］，而且這種抗炎反應可由種植體的表面特性調節，比如［14］經活性親水SLA(SLActive）處理的種植體與普通SLA種植體相比，其與炎癥細胞增殖相關的基因顯著下調的時間更早；相較于單純微粗糙表面處理方式，經氫氟酸納米涂層處理的種植體周圍組織中與抗炎細胞因子相關的基因會顯著上調［15］。Biguetti等［16］在小鼠口腔種植體骨結合過程中，發現大量炎性因子的表達水平在種植后第7d達到頂峰，其中精氨酸酶1（arginase，ARG1）和白介素10（interleukin-10，IL-10）兩種炎癥因子的表達正是M2型巨噬細胞對于創傷愈合做出的反應。Trindade等［7］比較兔股骨鈦種植體組和假手術組不同時間點所激活的免疫系統的基因表達時發現在第10d時，ARG1在鈦種植體周圍顯著上調，提示了M2巨噬細胞活化。Thalji等［13］采用全基因組微陣列分析發現雖然兩種處理方式種植體骨整合早期的分子表達在同一時間點無顯著差異，但第7d時與M2型巨噬細胞活化相關的標志物較第3d時明顯上調，而炎癥反應隨之下調，也提示了M2型巨噬細胞對于加速骨整合具有重要意義。Chen等［17］發現在LPS構建的炎癥微環境中，含Zn涂層的鈦納米管種植體會使M2型巨噬細胞相關基因表達增強，抑制M1型相關標志物表達。Li等［18］就發現硫酸軟骨素/聚多巴胺修飾聚對苯二甲酸乙二醇酯移植物可以調控M1型巨噬細胞向M2型轉變，促進促修復細胞因白介素4（interleukin-4，IL-4）、IL-10分泌，通過改善局部免疫微環境，引導干細胞的行為，促進新骨形成。

種植體骨結合早期的免疫反應在一定程度上影響后期種植體周圍的骨愈合，并且這種免疫反應受到種植體表面特性的調控。因此，充分利用巨噬細胞的可塑性，并進行合理的種植體表面修飾可能是改善種植體早期骨結合的潛在突破點。

2.成骨細胞基因表達

在胎兒期及出生后骨形態發生和發育過程中，可人為的將成骨分化途徑的細胞分為：未分化間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）、成骨祖細胞、前成骨細胞、成骨細胞和成熟骨細胞，但實際上它們之間并沒有明顯的區分界限［19］。在這一過程中大量細胞因子、生長因子通過Ras/MAPK、TGF-β/BMP和經典的Wnt/β-catenin在內的一系列信號轉導通路［20,21］介導MSCs的募集和分化。它們通過激活runt相關轉錄因子2（runt-related transcription factor 2，Runx2）、鋅指結構轉錄因子（osterix，Osx）、同源異形框（Dlx3、Dlx5、Msx1、Hox）等基因的表達促進骨特異性基因的轉錄，并指導MSCs有序的成骨分化。其中轉錄因子Runx2和Osx被認為具有“主開關”的作用，是成骨細胞分化的絕對要求。

Monjo等［22］報道了具有中等粗糙表面的鈦種植體的拔出力和貼壁組織面積還有穩定的成骨細胞標記基因的mRNA水平呈正相關。Guo等［23］觀察大鼠脛骨種植體早期骨結合過程中的成骨基因表達情況，發現第3d時Runx2，堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，Alp）表達明顯上調，第7d時除了Runx2，Alp繼續上調外，骨涎蛋白（bone sialoprotein，Bsp）的水平也顯著升高。Du等［24］觀察到假手術組大鼠上頜骨的Alp、骨鈣蛋白（osteocalcin，Ocn）、Ⅰ型膠原（collagen1，Col1）在3-7d顯著上調，但是雌激素缺乏所致的骨質疏松大鼠并沒有顯示出成骨基因表達的增加，表明雌激素缺乏在早期愈合反應中干擾了成骨細胞的成骨能力；Bryington等［15］觀察人下頜種植體早期骨結合過程中成骨基因表達情況，發現第1d的時候沒有明顯骨誘導現象出現，第3d時骨形態發生蛋白6（bone morphogenetic protein6，Bmp6）、骨橋蛋白（osteopontin，Opn）和Osx水平就明顯升高，第7d時，雖然兩組均有成骨基因的表達，但酸蝕處理組Osx和Ocn的表達顯著高于噴砂組。Jimbo［25］也發現在兔脛骨種植體骨結合過程中，第4周時納米磷酸鈣涂層處理組種植體周圍組織中Alp和Ocn的表達水平顯著高于對照組。Fang 等［26］則證實了應用Ca-antimiR138復合物修飾種植體表面可使MSCs成骨誘導過程中ALP活性提高至10倍以上。并且大量研究［27］證實種植體的納米地貌具有引導MSCs向成骨方向分化的潛力。

也就是說成骨細胞標記基因在種植體周圍組織表達的時間過程不僅遵循成骨細胞分化過程中的時間基因表達模式，而且峰值表達時間點在一定程度上會受到種植體類型、材料和表面形貌的影響，其中表觀遺傳調控、翻譯和翻譯后修飾［28,29］從分子水平上解釋了不同種植體表面處理方式對成骨基因表達差異的原因。

3.成骨細胞外基質的分子調控作用

完全分化的成骨細胞可分泌細胞外基質（extracellular matrix，ECM)，ECM有利于新骨沉積，是早期骨形成的基礎［30］，主要成分包括各種膠原蛋白（Collegen，COL）和非膠原蛋白（OPN、骨粘連蛋白、OCN、BSP、骨膜蛋白、細胞外基質蛋白-1、層粘連蛋白、整合素等）。而且細胞外基質蛋白的表達可作為早期成骨活性的可靠指標［31］評估種植體骨整合效果。

3.1 非膠原蛋白 骨橋蛋白是一種對于礦化十分重要的細胞外基質蛋白，Donos等［14］發現其在SLActive種植體植入7d后的周圍組織中表達明顯升高。骨鈣蛋白具有骨特異性，是成骨分化晚期的標志ECM蛋白，相較于微粗糙表面種植體，其在經氫氟酸納米涂層表面處理的種植體周圍組織中表達更高［15］。Ozawa等［32］觀察到相比于種植體植入前，種植體的植入后會顯著升高ECM中骨粘連蛋白、骨涎蛋白和整合素的表達水平。

3.2 膠原蛋白 膠原蛋白約占ECM的90%，其中含量最多的是COL1。由膠原蛋白交聯而成的膠原纖維決定了骨的生物力學性能［33］。除膠原蛋白外，與膠原纖維形成、加工和翻譯后修飾相關的蛋白也與ECM的生成相關，影響種植體早期骨結合的機械強度。

Ozawa等［32］觀察到相比于種植體植入前，植入后會顯著升高Col1A1，Col3A1的基因表達水平。Thalji等［13］通過基因芯片技術對人的種植體骨結合早期分子表達進行評估時發現，與3d時相比，第7d ECM中的Col1A1，Col1A2，Col3A1，Col6A1，Col6A3以及膠原纖維形成相關的基因，如熱休克蛋白-47（heat-shock protein-47，Hsp47）、前膠原蛋白c -內肽酶增強劑（procollagen C-endopeptidase enhancer，Pcolce），表達量顯著升高。膠原蛋白轉變為成熟的膠原纖維需要經過一系列翻譯后修飾，特別是發生在脯氨酸和賴氨酸殘基上，由脯氨酰4-羥化酶（prolyl-4-hydroxylases，P4H)，脯氨酰3-羥化酶（prolyl-3-hydroxylases，P3H)，或賴氨酰羥化酶（lysyl hydroxylases，LHs）介導的羥基化修飾對膠原交聯起著重要作用［34］，在這些生物合成步驟中涉及的任何蛋白質都可能影響最終的骨結合效果。研究發現［35］編碼P3H的基因突變后會導致膠原蛋白缺乏羥基化修飾而引起嚴重的常染色體隱性骨形成不全癥，P4H的雜合錯義突變會造成尖頭多指（趾）并指（趾）畸形［36］。Ogawa等［37］通過差異顯示PCR法篩選，P4H被鑒定為在種植體植入后顯著性上調的基因，Thalji等［13］發現種植體植入7d后編碼LHs的基因表達水平明顯升高，表明種植體誘導的P4H或LHs的上調可能有助于膠原交聯的增加，從而增加種植體周圍骨組織的硬度和剛度。表明了調節骨膠原基質翻譯后修飾的基因網絡可能在改善種植體周圍骨的力學性能方面發揮重要作用。

因此成骨ECM蛋白不僅可以作為早期成骨活性的可靠指標，而且膠原蛋白通過交聯形成的膠原纖維有利于早期骨的成熟，并保證成熟骨組織具有穩定的結構、良好的強度和彈性。

4.破骨細胞活性與骨重塑

骨穩態的維持需要成骨細胞介導的骨形成和破骨細胞介導的骨吸收之間的平衡調節。種植體骨結合過程中，成骨細胞介導的骨形成作用如第2部分所述，破骨細胞介導的骨吸收也同樣扮演著非常重要的作用。核因子κB受體活化因子/核因子κB受體活化因子配體/骨保護素（RANK/RANKL/OPG）是調控破骨細胞分化的重要信號通路，該信號通路激活時可以促進破骨細胞向分化［38］。另外，成骨細胞可通過RANKL刺激破骨細胞的活化，還可通過分泌OPG密切調控這一過程［39］。一項采用全基因組微陣列分析人骨整合過程早期分子表達的研究［13］發現，與3d相比，7d時可降解多種細胞外基質的基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）、破骨細胞活化標志物組織蛋白酶K（cathepsin K，CTSK）以及抗酒石酸酸性磷酸酶（type 5 acid phosphatase 5，ACP5）明顯升高。另外兩項體內研究也報告了這三者的升高。同樣地，Biguetti等［16］在小鼠口腔種植體骨整合的骨重塑過程中，發現MMPs（MMP1，MMP2，MMP9）、RANKL和OPG表達在植入種植體后逐漸上調并在第14d達到峰值，隨之破骨細胞數量逐漸增加。Lenneras等［40］在大鼠脛骨進行的一項體內研究關注到了，陽極氧化種植體會比普通機械加工種植體更早地誘導破骨細胞分化和隨后更強地骨重塑，從而加速骨-種植體界面的成熟。但是，Thalji［13］同時發現MMP抑制劑（TIMP-2，TIMP-3）在種植體表面也有上調，表明了機體對骨吸收過程的控制。有體外研究［41］發現培養人骨髓MSCs7d后，與SLA表面相比，SLActive表面破骨細胞相關基因顯著下調；另外有研究［42］證實具有槲皮素涂層的種植體具有良好的生物相容性和在體內外實驗中降低破骨細胞形成的能力，可用于改善種植體的性能。

總之，這些數據證實了骨結合的早期階段骨吸收的動態變化，并提出了種植體表面技術調節骨重塑的可能性。

5.總結

種植體骨結合早期過程中的免疫反應、成骨相關基因的時空表達、成骨細胞外基質的調控、破骨細胞活性改變及骨重塑等分子事件共同作用，形成了調控早期骨結合的復雜網絡，在改善種植體-骨結合界面的獨特生物、物理特性方面發揮了關鍵作用。但除此之外的血管形成、神經生成等骨代謝相關機制尚不明確，因此仍需要進一步通過基因組篩選、組學研究和生物信息學分析等手段全面了解與種植體骨結合相關的分子網絡，以篩選出可用于改善種植體骨結合的治療靶點，為提升種植修復效果提供良好的理論依據。