液相色譜技術在飼料中抗菌肽分離純化和含量測定的應用研究

何妍之

（揚州大學生物科學與技術學院，江蘇揚州 225009）

抗菌肽是一種廣譜抗菌的多肽類物質，對動物機體的細胞沒有毒害作用，耐藥性較低，已成為動物飼料中常用的添加劑。目前，抗菌肽已逐漸在動物養殖中應用。王曉楠等（2012）研究發現，飼料中添加抗菌肽能促進肉雞生長，顯著提高肉雞免疫功能。孫笑非等（2021）研究發現，抗菌肽作為豬飼料添加劑，能有效維持豬腸道菌群的平衡，促進腸道對飼料的消化與吸收，提高豬的生長速率，改善機體免疫功效。史慶超等（2014）發現，在飼料中添加抗菌肽能顯著提高吉富羅非魚的生長速率和免疫功能。黃小紅等（2018）發現，添加抗菌肽能促進草魚的生長發育，顯著提高草魚的免疫功能?？咕氖且环N綠色飼料添加劑，具有穩定性強、分子量小、抗菌效果好等特點。

抗菌肽是一類小分子物質，來源于生物體內的水解物，在正常情況下，大多數抗菌肽帶正電荷。飼料中抗菌肽的分離純化作用機制是帶正電荷的抗菌肽和帶負電荷的離子交換劑結合在一起，抗菌肽與固定相結合，經高離子緩沖液對抗菌肽進行洗脫，將抗菌肽從離子交換劑洗脫到緩沖液中，從而分離出抗菌肽。針對飼料原料內各組成分的測定，高效液相色譜技術具有檢測速度快、靈敏度強、安全和精確度強等特性。高效液相色譜技術在高分子蛋白的應用優勢較為明顯，能更好地精準確定高分子蛋白等的分子質量和結構。因此，高效液相色譜技術在飼料蛋白分子測定中廣泛應用。本文對飼料添加劑中的抗菌肽采用高效液相色譜技術進行分離純化，并測定飼料添加劑抗菌肽的含量，為飼料產品中抗菌肽的含量提供合適的檢測方法，為飼料中抗菌肽的開發利用提供有效參考。

1 材料與方法

1.1 實驗原料 飼料、抗菌肽樣品。

1.2 試劑和溶液 甲醇、磷酸（分析純）、純凈水（分析純）。

標準溶液配置：稱量5 g標準抗菌肽制品，將其放入100 mL錐形瓶中，配制抗菌肽樣品濃度為3 mol/L的儲備液，放入4℃冰箱中保存備用。臨用時將儲備液稀釋10倍，配制流動相標準工作溶液，標準溶液分別為 0.25、0.5、0.75、1和1.5mol/L的標準溶液。

對照溶液：取5 g飼料樣品放入天平中，精準稱量飼料樣品質量，將其放入250 mL錐形瓶中，加入適量無水乙醇，超聲波加速溶解，冷卻，加入無水乙醇稀釋到容量瓶刻度線，搖勻，作為對照組樣品。對照組樣品溶液進行搖勻、過濾和冷置，制備陰性對照組樣品。

1.4 固相萃取柱 本實驗采用固相萃取柱洗脫和分離飼料樣品，固相萃取柱用4 mL甲醇和堿性溶液活化，用飼料提取液初步潤洗固相萃取柱，飼料提取液流速設置為2 mL/min，再用滅菌水和甲醇洗脫，收集固相萃取洗脫液體。洗脫液放入濾膜過濾后進行混合，而后使用高效液相色譜儀檢測洗脫液。

1.5 液相色譜儀條件 本實驗采用液相色譜柱為C18柱，固定流動相為甲醇-純凈水（體積比為9∶1），固定流動相的流速控制為2 mL/min，保持色譜柱溫度為32℃，高效液相色譜儀的檢測樣品量為10 uL，儀器的檢測波長控制在550～850 nm，多次反復測量液相色譜圖。

1.6 飼料抗菌肽分離純化的線性關系測定 將5 g標準抗菌肽樣品放入250 mL錐形瓶中，加入無水乙醇，采用高溫加熱加速標準樣品溶解，制定標準溶液，將其作為對照組。用3 mol/L抗菌肽標準溶液分別配置濃度為 0.25、0.5、0.75、1 和 1.5mol/L的標準溶液。各標準溶液組用移液槍量取10 μL放入高效液相色譜儀中，測定各組的峰面積，以各組峰面積為縱坐標，各組樣品濃度為橫坐標建立線性方程，測定其含量變化。

1.7 樣品回收率實驗 將適量樣品放入500 mL回收瓶中，分別加入對照組液體5 mL，依照對照組液體配置回收樣品，對樣品濃度進行測定，并計算樣品回收率。

2 結果與分析

2.1 飼料中抗菌肽的分離純化條件優化 抗菌肽易溶于水和醇類，本實驗對飼料中抗菌肽采用初步提取法，有效提高抗菌肽的純度，再用高效液相色譜法進行分離純化，高效液相色譜儀的流動固定相為甲醇，甲醇與水的體積比為9∶1，雜質與抗菌肽的分離效果好。

2.2 飼料中抗菌肽的液相色譜條件的優化 建立液態流動相，采用紫外檢測器對流動相抗菌肽溶液掃描檢測，定量結果由圖1所示，紫外檢測飼料中抗菌肽溶液的波長最大值為526 nm，吸光度最大。因此，飼料中抗菌肽溶液的檢測波長為526 nm，結果準確，無雜質干擾。

圖1 抗菌肽紫外檢測圖

飼料中抗菌肽用C18柱進行色譜分離，使飼料抗菌肽與其他雜質分離，結果準確度高，且純度更高。本實驗對抗菌肽的液相色譜條件進行分析和優化，包括色譜柱溫度、流動相體積比、流動相速率及樣品停留時間，實驗結果發現，高效液相色譜中提高流動相速率，流動相甲醇體積比及液體流動時間都對色譜圖中峰的寬度有影響；實驗將流速設置為0.75 mL/min，甲醇體積比為10%，柱溫度為31℃。流動相中加入一定量的酸性溶液會有效改變色譜圖的峰值，且磷酸-甲醇為流動相時，該峰線平穩，峰值穩定。為了維持液相色譜儀中色譜柱的安全有效性，流動相加入磷酸的效果遠遠高于甲酸和乙酸。由圖2高效色譜圖結果可知，該條件下抗菌肽的停留時間為7.56 min，且保持良好的峰值狀態。

圖2 抗菌肽標準溶液液相色圖譜

2.3 飼料中抗菌肽分離純化的結果分析 飼料中抗菌肽液體經過高效液相色譜儀分離純化后，經過固相萃取后所得上清液，再經膜過濾后得到4個組分，結果如表1。由表1可知，抗菌肽的上清液經過膜過濾后被分離層析為各組成分，上清液中抗菌肽的含量最高，低于5 ku的抗菌肽濃度最小，總抗菌肽含量最低，5-10 ku的抗菌肽分子的活性最高，低于5 ku的抗菌肽活性為0。

表1 飼料中抗菌肽分離純化的結果

2.4 飼料中抗菌肽的固相萃取柱的處理方法分析 抗菌肽上清液進行過膜過濾后，上高效液相色譜儀進行測定，操作較為便捷。本研究中采用固相萃取柱對抗菌肽上清液進行凈化與濃縮，用甲醇和氫氧化鈉進行活化，抗菌肽的離子化程度加強，更易保留在萃取柱中。該抗菌肽的上清液更好過固相萃取柱，用甲醇淋洗，將液體洗脫完畢后，抗菌肽的上清液流入洗脫液中。由圖3所示，飼料中抗菌肽上清液經過固相萃取柱濃縮后，其色譜峰值的基線更低，抗菌肽濃度更高，以達到凈化目的。

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圖3 固相萃取柱飼料中抗菌肽的高效液相色譜圖

2.5 飼料中抗菌肽含量的線性關系分析 以抗菌肽的標準溶液為參照對象，依據優化的抗菌肽標準色譜條件進行飼料抗菌肽的含量定量分析。以標準抗菌肽溶液為縱坐標，色譜峰的面積值為橫坐標建立線性標準方程。

該標準方程圖如4所示：

由圖4可知，標準曲線方程為：y=aX+b，a=554.25，b=321622，R2=0.9644，結果表明，飼料中抗菌肽樣品濃度和色譜峰面積呈現線性關系，相關系數是0.964。

圖4 飼料中抗菌肽含量的線性關系

抗菌肽溶液按照相關稀釋倍數進行稀釋，液相色譜儀測定進樣抗菌肽濃度為0.5 mol/L，確定其本實驗抗菌肽的測定量為3mg/kg。

2.6 液相色譜的穩定性分析 采用液相色譜分析法對動物飼料添加劑、水產動物飼料和家禽飼動物料抗菌肽含量進行測定，按照上述要求進行處理，在高效液相色譜儀中連續進樣10次，測定不同類型飼料樣品的起峰時間和峰值大小，并計算其相對偏差。結果表明：動物飼料添加劑，水產動物飼料和家禽動物飼料中抗菌肽色譜圖中，不同樣品的起峰時間和峰值大小的相對標準偏差低于0.5%，平均值較為穩定，結果證實該高效液相色譜的測定結果較為穩定。

2.7 液相色譜的精密度和準確性分析 參照前面的飼料抗菌肽添加水平，對不同類型的飼料添加不同含量的抗菌肽，每組測定10個重復。由表3可知，動物飼料添加劑、水產動物飼料和家禽飼動物料的抗菌肽回收率分別為96.4%、98.4%和99.7%，且相對標準偏差均小于0.5%，結果表明，液相色譜儀測定數據的精密度和準確性良好。

表2 液相色譜的穩定性分析

表3 液相色譜的精密度和準確性分析

2.8 飼料中抗菌肽的含量測定 本研究采用液相色譜儀測定標準不同類型飼料中抗菌肽含量。結果發現，液體動物飼料添加劑的抗菌肽測定值為2.45 mg/kg，水產動物飼料和家禽動物飼料的抗菌肽測定值分別是3.14和2.56 mg/kg。圖譜（圖5-6）結果表明，標準樣品中抗菌肽沒有雜質干擾，只有抗菌肽一個峰，飼料中抗菌肽樣品峰值與標準峰值完全重合，說明色譜的前期處理和液相色譜條件較好。

表4 飼料中抗菌肽的含量測定

圖5 抗菌肽標準溶液的色譜圖

圖6 待測飼料中抗菌肽樣品中色譜峰圖

3 討論

3.1 高效液相色譜測定方法的優勢分析 抗菌肽作為一種綠色飼料添加劑，在動物生長發育和免疫防護中起到重要作用。從飼料添加劑中分離純化抗菌肽具有廣闊的發展空間。根據抗菌肽的物理特性，凝膠過濾分析和離子交換層析被應用于抗菌肽的初步過濾，將初步處理的抗菌肽液體放入高效液相色譜儀進行分離純化。樊陳等（2013）對地衣芽孢桿菌的抗菌肽分離純化進行研究，結果發現，初步發酵地衣芽孢桿菌，發酵液被離心機分離后，經超濾濃度和離子交換層析等步驟，濃縮液被分子篩凝膠過濾和層析后，將濃縮液體放入液相色譜儀中獲得分離純化的抗菌肽。本實驗中地衣芽孢桿菌的抗菌肽分離純化分4步，但其濃縮液進行2次層析，將會增加樣品分離純化的成本，操作過程繁瑣。陳雪麗等（2007）對芽孢桿菌的菌體蛋白分離純化過程進行深入研究，本實驗采用硫酸銨分級沉淀和固體液相柱層析獲得菌體蛋白，該方法提取的蛋白含量較低，損耗較大。于佳民等（2021）采用超濾濃縮對芽孢桿菌中抗菌肽進行初步分離，且損耗較少，分離速率快，便于操作，凝膠層析采用層析柱來分離不同大小的蛋白，分離范圍較為精準，符合抗菌肽的分離條件。本研究對飼料中抗菌肽樣品進行研磨，用超濾過濾方法進行初步分離，再用固相萃取柱對飼料樣品溶液進行濃縮，濃縮液均采用濾膜過濾后，最后濃縮液放入高效液相色譜儀即可獲得飼料中分離純化的抗菌肽，該方法操作簡單，且分離速率快，靈敏度高，方法準確。

本研究表明，抗菌肽在甲醇、磷酸中均可溶解，此次選用甲醇作為液態流動相，且溶解效率高。因此，本研究用甲醇作為溶劑，溶解效率高，便于提高實驗結果的準確度。采用高效液相色譜儀分離純化飼料中的抗菌肽，對抗菌肽的色譜條件進行優化，發現流動相的流速、比例及固相萃取柱溫度都會影響實驗結果。因此，本實驗對飼料中抗菌肽的分離純化高效液相色譜條件進行優化，精準測定飼料中抗菌肽的含量，為飼料中抗菌肽添加量提供參考依據。

3.2 采用高效液相色譜測定方法對不同類型飼料抗菌肽含量精確分析 本實驗對不同類型飼料抗菌肽添加量結果的穩定性和精密度進行分析、比較，采用高效液相色譜儀測定不同類型飼料樣品抗菌肽的起峰時間和峰值大小，分析不同類型樣品的相對偏差，結果表明，不同類型飼料抗菌肽的起峰時間和峰值面積相對偏差較小，測定抗菌肽的結果穩定性強，精密度高，準確度強。張二鵬等（2021）利用高效液相色譜法測定保健食品中鞣花酸的含量，結果發現，經高效液相色譜儀測定的結果準確性、靈敏度、精密度高，穩定性強，與本研究結果類似。

本研究采用高效液相色譜分析法對不同類型飼料中抗菌肽進行分析，結果發現，標準樣品中抗菌肽峰值與飼料待測樣品的抗菌肽峰值相似，表明結果的精密度高，準確度強，且能有效測定飼料中不同類型的蛋白大分子含量，也為飼料樣品含量的測定研究提供了理論依據。

4 結論

本研究最佳的飼料抗菌肽分離純化方法是高效液相色譜法，發酵液采用超濾層析和固相萃取法對其進行濃縮和層析，樣品溶液經過濾后放入高效液相色譜儀獲得分離純化的抗菌肽，在此基礎上，抗菌肽的保留時間為7.25 min，當濃度為500～3800g/L時，飼料中抗菌肽的峰面積與抗菌肽樣品濃度呈線性關系，且準確度高，精密度強。該方法具有操作方便、檢測速率快、靈敏度高和應用范圍廣泛等優點。