赤芍治療肝纖維化網絡藥理學機制探討

安禎祥,張安邦,何遠利,黃 丹,王 敏,唐東昕,王 芳

(貴州中醫藥大學第一附屬醫院,貴州 貴陽550001)

肝纖維化(Hepatic fibrosis,HF)是指肝臟中細胞外基質的彌漫性過度沉積與異常分布,是肝臟的病理性修復反應,是慢性肝病向肝硬化/肝癌發展的關鍵步驟和重要環節。肝纖維化在組織學上是可逆的,而肝硬化難以逆轉[1]。有效地預防、逆轉肝纖維化可以延緩或防止肝硬化發生。目前尚無治療纖維化的化學或生物藥物,而中醫藥在該領域有明確的優勢[2]。抗纖維化治療是一個綜合治療,其中病因治療和抗炎治療是首要策略,但是針對細胞外基質沉積和降解,抑制肝星狀細胞活化仍然是不能替代的治療。赤芍是活血涼血、散瘀止痛的代表藥物,廣泛用于急慢性肝病治療中。但是作為單一用藥,需進一步深入研究。赤芍(Paeoniae RadixRubra)為毛茛科植物芍藥(Paeonia lactifloraPall.)或川赤芍(Paeonia veitchiiLynch)的干燥根,味苦,微寒,入肝經,具有涼血散瘀、清熱止痛的功效,可用于肝郁脅痛、癥瘕腹痛等肝膽疾病[3-5]。研究表明赤芍具有一定的保肝、抗肝纖維化作用[6-9]。然而其抗HF藥效物質及作用機制需要進一步明確。中藥網絡藥理學是多學科的交叉產物,利用系統生物學、系統藥理學、分子生物學、生物信息學、計算機技術等,突破了傳統“單藥物、單靶點、單途徑”,切合中藥的“整體性、多靶點、多通道”特點,通過構建藥物與基因、靶點和疾病之間的相互作用網絡,探尋中藥的作用機制。本研究采用網絡藥理學方法對赤芍抗HF的活性成分、作用靶點和信號通路進行分析,探討其治療肝纖維化的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 赤芍活性成分與作用靶標的篩選

利用TCMSP數據庫(https://tcmspw.com/tcmsp.php)篩選赤芍所有化學成分,以口服生物利用度(Oral bioavailability,OB)≥30%和類藥性指數(Drug like index,DL)≥0.18為篩選指標,活性成分輸入TCMSP數據庫檢索其作用靶標,運用Uniprot數據庫査詢靶標蛋白對應的基因名稱。

1.2 肝纖維化疾病靶標收集

以“hepatic fibrosis”為關鍵詞,檢索GeneCards(https://www.genecards.org)數據庫、OMIM(https://www.omim.org)數據庫中肝纖維化相關基因,并去除重復基因。

1.3 赤芍活性成分靶點與肝纖維化靶點蛋白相互作用

將赤芍有效活性成分作用靶點與肝纖維化靶點取交集,得到兩者的韋恩圖。

1.4 成分-疾病-靶點網絡構建

在GeneCards(http://www.genecards.org/)、OMIM(http://www.omim.org/)數據庫中檢索肝纖維化疾病相關靶蛋白,物種設置為人類,利用Uniprot(http://www.uniprot.org/)數據庫將其轉化為基因名稱,采用R語言提取成分作用靶點與肝纖維化疾病靶點的共有靶點,Cytoscape 3.7.1軟件構建赤芍活性成分-疾病-靶點網絡。

1.4 PPI網絡構建與可視化

String(https://string-db.org)數據庫收集了大量的蛋白質-蛋白質相互作用關系(Protein-protein interactions,PPI)。將赤芍活性成分靶標與肝纖維化疾病靶標的共有靶點導入String數據庫,物種限定為“Homo sapiens(人)”,構建赤芍成分靶標-肝纖維化疾病靶標PPI。采用R語言篩選出PPI中的前30個核心蛋白。使用Cytoscape 3.7.1軟件對PPI網絡進行分析和可視化處理,得到赤芍治療肝纖維化的蛋白相互作用的PPI柱狀圖和點狀圖。

1.5 基因功能及通路富集分析

Gene ontology(http://www.geneontology.org)廣泛用于基因功能的注釋。Kyoto Encyclopediaof Genes and Genomes(KEGG,https://www.kegg.jp)是一個整合化學、基因組和系統功能信息的數據庫,用于從分子水平信息中了解生物系統的高級功能和用途。將赤芍治療HF關鍵靶標用R語言及Bioconductor進行基因功能和通路富集分析,通過條形圖及氣泡圖展示。

2 結果

2.1 赤芍活性成分與靶點篩選

在TCMSP數據庫中檢索得到赤芍化合物119個,其中OB≥30%,DL≥0.18的活性成分29個,獲取赤芍化學成分及作用靶標信息,包括芍藥苷、芍藥苷元酮、谷甾醇、菠菜甾醇、豆甾醇、兒茶素、并沒食子酸、(2R,3R)-4-甲氧基-二苯乙烯、β-谷甾醇、黃芩素、campest-5-en-3beta-ol、stigmast-7-en-3-ol等化合物。見表1。根據赤芍活性成分預測其作用靶標,12個活性成分共作用于74個靶標,去除重復靶標,獲得41個靶標,可見一個成分作用多個靶點,亦可見多個活性成分作用同一靶標。運用Uniprot數據庫査詢靶標蛋白對應的基因簡稱。見表2。

表1 赤芍的活性成分

表2 赤芍的藥物靶點

2.2 肝纖維化疾病靶標收集結果

GeneCards和OMIM數據庫收集HF疾病靶標4 033個。肝纖維化主要通過CF跨膜電導調節器、轉化生長因子Beta 1、腫瘤壞死因子、干擾素γ、端粒酶逆轉錄酶、IL6等靶點進行調節。圖3為部分靶點。

續表2

續表2

表3 肝纖維化部分靶點

續表3

2.3 赤芍成分靶點-肝纖維化靶點交集

在TCMSP數據庫中搜索得到赤芍治療疾病的靶標41個,GeneCards數據庫與OMIM數據庫搜索HF疾病的靶點4 033個,使用R語言對赤芍作用靶點與肝纖維化的疾病靶點取交集,構建赤芍活性成分靶點-肝纖維化靶點韋恩圖,獲得赤芍與HF共同作用靶標33個。見圖1。

2.4 赤芍抗肝纖維化主要活性成分-靶點網絡構建

應用Cytoscape軟件構建赤芍抗肝纖維化成分-靶點網絡,見圖2。其中一個疾病節點,1個藥物節點,12個藥物活性成分節點,33個肝纖維化相關基因節點,赤芍的12種活性成分協同作用于33個肝纖維化基因,三角形、橢圓形節點分別代表赤芍活性成分、疾病的靶蛋白,邊代表藥物、活性成分和疾病靶蛋白的相互作用,體現了赤芍抗肝纖維化多成分、多靶點協同作用的特點。結果表明,赤芍29種活性成分中,與HF作用靶點直接相連的有12種活性成分,為赤芍治療HF的有效活性成分,分別為芍藥苷、芍藥苷元酮、谷甾醇、菠菜甾醇、豆甾醇、兒茶酚、并沒食子酸、(2R,3R)-4-甲氧基-二苯乙烯、β-谷甾醇、黃芩素、campest-5-en-3beta-ol、stigmast-7-en-3-ol。可見多個成分同時作用于一個或幾個相同的靶點,部分靶點有多個作用成分,因此這些的靶點和成分成為赤芍中主要的活性成分和靶點。

圖2 赤芍-肝纖維化-成分-基因網絡圖

2.5 赤芍靶點蛋白相互作用網絡分析

利用STRING軟件,將韋恩圖中33個靶點作出蛋白質-蛋白質相互作用網絡圖及柱狀圖,結果IL6、VEGFA、ESR1、FOS、CASP3、RELA、AR、CYCS、CASP8、PGR、CASP9、HIF1A、CCNB1等基因處于核心地位,分別有20、19、18、18、17、17、15、14、12、12、11、11、10節點。見圖3、圖4所示。

圖3 赤芍與HF共有PPI網絡圖

圖4 赤芍抗HF作用靶點PPI分析

2.6 赤芍治療肝纖維化基因功能富集分析

為進一步了解赤芍治療肝纖維化關鍵靶標在生物體中發揮的作用,運行R語言對33個關鍵靶標進行GO基因功能富集分析,共獲得73個生物學功能,根據P-vaule大小進行排序,選取前20條目展示,見圖5。柱狀圖中縱坐標表示P值,橫坐標表示富集的數目。P值越小顏色越深。結果顯示,赤芍治療肝纖維化關鍵靶標主要富集在對DNA結合轉錄激活因子活性、RNA聚合酶II特異性、核受體的活動、類固醇激素受體活性、RNA聚合酶II轉錄因子結合、RNA聚合酶II近端啟動子序列特異性DNA結合、泛素樣蛋白連接酶結合、G蛋白偶聯受體活性、近端啟動子序列特異性DNA結合、神經遞質受體的活動功能活動中。

圖5 赤芍抗肝纖維化作用靶點的GO分析

2.7 赤芍治療肝纖維化通路富集分析

運行R語言對33個關鍵靶標進行KEGG通路富集分析,符合篩選條件的信號通路有78條,顯示P值最小的前20條通路繪制氣泡圖,見圖6。氣泡圖中縱坐標表示通路的名稱,橫坐標表示通路所占比例。P值越小顏色越深。其中與肝纖維化相關程度密切的信號通路有細胞凋亡、Th17細胞分化、IL-17信號通路、HIF-1信號通路、p53信號通路。赤芍抗HF部分通路圖(乙肝、IL-17信號通路、細胞凋亡)。見圖7-圖9。

圖6 赤芍抗肝纖維化作用靶點的KEGG分析氣泡圖

圖7 赤芍對乙型肝炎作用靶點的作用位置

圖9 赤芍對細胞凋亡作用靶點的作用位置

3 討論

肝纖維化屬于中醫“脅痛”“積聚”范疇,基本病機為正虛瘀積,肝絡受損,與肝絡病密切相關。肝絡是指肝臟的小血管,能營養肝臟及調節肝臟功能。肝纖維化病理關鍵為假小葉,假小葉病理基礎在肝血竇。肝絡與肝血竇的結構與生理相似,具有密不可分的關系,因此從“絡病”治療肝纖維化是一個重要的方法[10]。赤芍具有活血化瘀功效,是絡病治療的較好選擇。

圖8 赤芍對IL-17信號通路作用靶點的作用位置

通過TCMSP數據庫,按口服生物利用度(OB)≥30%且類藥性(DL)≥0.18的條件篩選赤芍活性化學成分29個,包括芍藥苷、芍藥苷元酮、谷甾醇、菠菜甾醇、豆甾醇、兒茶素、并沒食子酸、(2R,3R)-4-甲氧基-二苯乙烯、β-谷甾醇、黃 芩 素、campest-5-en-3beta-ol、stigmast-7-en-3-ol等 化合物,其中主要的化學成分是單萜苷類、酚類、多糖等化合物,單萜苷類含有芍藥苷、芍藥新苷、芍藥內酯苷、芍藥苷元酮、芍藥甙元酮、苯甲酰芍藥苷、苯甲酰羥基芍藥苷[11]。研究表明,赤芍中芍藥苷、兒茶素以及β-谷甾醇的量較高[12],這些化學成分為其功效的基礎。芍藥苷及芍藥內酯苷對四氯化碳所致小鼠急性肝損傷有明顯的保護作用[13]。芍藥苷對二甲基亞硝胺誘導的肝纖維化起保護作用[14];芍藥苷也可通過TGF-β1/Smads信號通路對放射引起的大鼠肝纖維化起保護作用[8,15]。β-谷甾醇對小鼠肝纖維化有保護作用,其機制可能與TGFβ/Smad2/3和TNF-α-NF-κB信號通路相關[16]。可下調Ⅰ型膠原纖維和α-SMA的基因和蛋白表達[17]。

從赤芍治療肝纖維化的“成分-靶點-疾病”交互網絡中,赤芍治療肝纖維化的效應機制可能與IL6、VEGFA、ESR1、FOS、CASP3、RELA、AR、CYCS、CASP8、PGR、CASP9、HIF1A、CCNB1等靶標基因相關。肝竇毛細血管化則肝細胞物質交換出現障礙。肝纖維化伴隨肝竇毛細血管化,肝臟新生血管與肝纖維化的發生密切相關[18]。組織缺氧誘導因子(HIF-1α)促進VEGF表達和轉錄增強,促進新血管生成,HIF-1α/VEGF信號通路是肝纖維化的重要調節通路[19]。IL-6與肝細胞炎癥壞死嚴重度及纖維化程度關系密切[20]。炎癥機制是各種病因所致慢性肝病發生發展的一個共同過程,是肝纖維化進展的核心機制,從這一機制著手進行肝纖維化診治具有重要價值[21]。NF-κB可通過調控多種抗炎因子的表達來影響肝纖維化的進展,NF-κB抑制劑也已在臨床上得到應用。NF-κB對Ⅰ、Ⅲ型膠原基因轉錄上調及肝纖維化的形成具有重要調節作用[22]。肝纖維化與NF-κB信號通路的多種炎癥介質有關[23],NF-κB信號通路通過對肝細胞、HSC等細胞的調節,影響肝纖維化的發展[24]。RELA是NF-κB通路中的主要活性成分,可影響肝纖維化的形成[25]。GO基因功能分析表明赤芍治療肝纖維化關鍵靶標主要富集在DNA轉錄、復制,細胞生長、凋亡功能活動中。KEGG通路富集分析,與肝纖維化密切相關的有細胞凋亡、Th17細胞分化、IL-17信號通路、HIF-1信號通路、p53信號通路。研究表明,赤芍水提物影響bcl-2、bax、caspase-3三種蛋白表達,促進活化的HSC凋亡,減少酒精性肝纖維化的發生[26]。可見赤芍干預治療肝纖維化具有多成分、多靶點的特點。

綜上所述,本研究基于網絡藥理學方法探析赤芍治療肝纖維化的分子機制,赤芍12個活性成分共作用于41個靶標,可見一個成分作用多個靶點,亦可見多個活性成分作用同一靶標,可影響細胞生長、凋亡、核受體活性、DNA轉錄、復制等生命活動,可通過細胞凋亡、Th17細胞分化、IL-17信號通路、HIF-1信號通路、p53信號通路干預治療肝纖維化,多種活性成分通過多靶標、多途徑、多通路、協同作用治療HF,為赤芍治療肝纖維化的藥效物質基礎及作用機制提供了參考。