正交試驗優選椒桂酊的提取工藝研究

張慶蓮,皮鳳娟,黃 娟,許 曾,張世波

(瀘州市中醫醫院,四川 瀘州646000)

椒桂酊源于《黃帝內經》中的藥熨方,由花椒、干姜、肉桂組成,藥味均有辛熱之性,具有溫陽散寒、通脈止痛的功效[1-2],可用于寒邪引起的各種疼痛,如寒痹、肩凝癥、心腹寒氣痛、跌打損傷、風寒濕痹癥、盆腔炎等[3-4]。《黃帝內經》中藥熨方的用藥方法是連同藥渣一起外敷于患處[5],用藥過程麻煩,且不利于攜帶和保存,經查閱文獻,目前尚無將藥熨方開發為酊劑使用記載。因此,本研究將其開發為醫療機構制劑,經系統研究,制成工藝穩定、使用方便的酊劑。本研究采用正交試驗法考察藥材粒度、浸出時間和乙醇濃度3個因素,以桂皮醛含量、總固體量兩種指標進行綜合評價,優選出最佳提取工藝,為椒桂酊的工業化大生產提供參考。

1 材料

1.1 儀器

電子天平(FA2004型,上海安亭電子儀器廠),電子天平(SQP型,北京賽多利斯),電熱鼓風干燥箱(GZX-GF101-3-BS-Ⅱ/H型,上海躍進醫療器械有限公司),高效液相色譜儀(Agilent 1260型,美國安捷倫)。

1.2 試藥

桂皮醛對照品(純度99.6%,批號110710-201821,由中國食品藥品檢驗研究院提供);花椒(批號191001131)、干姜(批號190302441)、肉桂(批號181201481),由成都康美藥業生產有限公司提供,3種藥材經全檢,均符合《中華人民共和國藥典》2015年版一部項下的有關規定。3種中藥飲片經主任中藥師張世波鑒定為正品。水采用超純水,乙腈采用色譜純,其余試劑采用分析純。

2 方法及結果

2.1 溶劑用量確定

對處方量藥材進行吸醇率考察,按處方比例稱取適量藥材置于燒杯中,加60%、70%、80%3種濃度乙醇分別浸漬,在浸泡10 min、20 min、30 min、40 min、60 min、90min、120 min、180min、240min、360min、480min時間點測定相應濃度的乙醇體積。以時間(min)為橫坐標,吸醇量(m L)為縱坐標,繪制不同加醇濃度在不同時間的吸醇率圖譜,見圖1。結果顯示,120 min后吸醇量增加緩慢并趨于平衡。為保證與傳統用藥一致,采用傳統提取工藝浸漬法進行提取[6]。根據吸醇率考察結果看,120 min后吸醇量基本趨于平衡,此時的量約為藥材量的1.5倍。根據《中華人民共和國藥典》四部通則“酊劑”項下的要求,100 m L藥液相當于20g藥材[7],即藥液比為1∶5,加上藥材吸醇量,根據預試驗結果,采用6倍量的溶劑浸漬,吸取上清液加入少量溶劑至規定量即可。

圖1 吸醇率

2.2 正交試驗設計

經查閱文獻[8-10]資料,選擇藥材粒度(因素A)、浸漬時間(因素B)與乙醇濃度(因素C)作為工藝考察的影響因素,采用4因素3水平正交試驗表(即L9(34)正交表)對提取工藝進行考察,以桂皮醛含量及總固體量兩種指標為考察指標,綜合評分=(桂皮醛含量/桂皮醛含量最大值)×60+(總固體量/總固體量最大值)×40。因素與水平見表1。

表1 因素與水平

2.3 正交試驗提取液的制備

稱取處方比例的藥材,按正交試驗設計表1、表6分別加入6倍量溶劑,浸漬一定天數,濾過,定容即得。

2.4 總固體測定

將9個正交試驗的浸漬液分別精密量取25 m L于已恒重的蒸發皿中,蒸干,放入105℃電熱恒溫鼓風干燥箱中烘3 h,取出,置干燥器中冷卻30 min,迅速精密稱定質量,計算浸出物得率[11],見表6。

2.5 桂皮醛含量測定

2.5.1 對照品溶液制備 精密稱取桂皮醛對照品適量,加入乙腈至容量瓶中稀釋至刻度,搖勻,制成11.23 mg/m L的對照品母液;再精密量取桂皮醛對照品母液0.5 m L于10 m L容量瓶中,加入乙腈至容量瓶中稀釋至刻度,搖勻,制成11.23μg/m L的對照品溶液。

2.5.2 供試品溶液制備 精密量取1 m L藥液,放入50 m L容量瓶中,將甲醇加入容量瓶中稀釋至刻度,搖勻后,再用0.45μm的微孔濾膜過濾,取續濾液作為供試品溶液。

2.5.3 陰性溶液制備 稱取缺肉桂的其他藥材,加入6倍量溶劑,浸漬,濾過,照供試品溶液的制備方法進行制備,即得陰性溶液。

2.5.4 色譜條件與系統適用性試驗 色譜條件為采用ZORBAX SB-C18(5μm,250mm×4.6mm)色譜柱;流動相比例為乙腈-水(35∶65);柱溫為30℃;流速為1 m L/min;檢測波長為290 nm。將桂皮醛對照品溶液、缺肉桂陰性溶液、椒桂酊供試品溶液,分別注入10μL于高效液相色譜液中測定峰面積,結果陰性無干擾。見圖2。

圖2 桂皮醛對照品、椒桂酊供試品、缺肉桂陰性溶液色譜

2.5.5 線性關系考察 精密量取已配制好的桂皮醛對照品母液0.1、0.3、0.5、0.7、1.0、1.2 m L,分別置于容量瓶中,加入色譜乙腈稀釋并定容至10 mL,根據“2.5.4”項下色譜條件,分別注入10μL于高效液相色譜儀中進行峰面積測定,以進樣量X(μg)為橫坐標,峰面積Y為縱坐標,計算回歸方程,結果為Y=182.52X+28.222(r=1),說明桂皮醛在1.123~16.845μg范圍內線性關系較好。

2.5.6 精密度考察 精密量取桂皮醛對照品溶液,根據“2.5.4”項下色譜條件,分別注入10μL于高效液相色譜儀中進行峰面積測定,重復進樣6次,結果RSD為0.42%,說明儀器精密度較好。見表2。

表2 精密度試驗

2.5.7 重復性考察 取同一批次藥液6份,按“2.5.2”項下供試品溶液制備方法制備樣品,根據“2.5.4”項下色譜條件,分別注入10μL于高效液相色譜儀中進行峰面積測定,結果RSD為1.52%,說明重現性較好。見表3。

表3 重復性試驗

2.5.8 穩定性考察 取同一供試品溶液,按“2.5.4”項下色譜條件,分別于不同時間點(0、2、4、6、8h)注入10μL于高效液相色譜儀中進行峰面積測定,結果RSD為0.83%,說明供試品溶液在8 h內穩定。見表4。

表4 穩定性試驗

2.5.9 加樣回收率試驗 精密量取6份已知桂皮醛含量的樣品0.5 m L,分別加入桂皮醛對照品溶液,使其加入量相當于樣品中桂皮醛含量的50%,按“2.5.2”項下方法處理樣品溶液,按“2.5.4”項下色譜條件測定含量,計算回收率。結果平均回收率為100.71%,RSD為1.06%(n=6),表明方法準確度良好。見表5。

表5 回收率試驗

2.6 正交結果

采用兩種指標綜合評分,其中總固體量占40%,桂皮醛含量占60%,結果見表6、表7。

表6 L9(34)正交試驗結果

表7 方差分析結果

根據表6、表7分析結果,因素A(藥材粒度)P<0.01對綜合評分結果有顯著性影響,因素B(浸漬時間)P>0.05、因素C(乙醇濃度)P>0.05對綜合評分結果無顯著性影響。根據表6中R值比較,影響因素大小為A>B>C。其中,因素A中K1>K2>K3,因素B中K3>K2>K1,因素C中K2>K3>K1,因此,優選出的最佳工藝為A1B3C2,即藥材粒度為飲片,加6倍量70%乙醇,浸漬14 d。

2.7 驗證試驗

根據正交試驗優選的最佳工藝A1B3C2進行提取,做3個驗證試驗,測定桂皮醛含量及總固體量。結果桂皮醛平均含量為10.32 mg/g,RSD為2.93%,總固體平均含量為11.96%,RSD為0.19%,說明優選的工藝穩定可行。

3 討論

(1)試驗過程中桂皮醛對照品采用2015年版《中華人民共和國藥典》中的制備方法,加入甲醇溶解,結果發現,桂皮醛在甲醇中不穩定。經查閱文獻[12]顯示,桂皮醛在甲醇中不穩定,但在乙腈及乙酸乙酯中穩定,因此含量測定中桂皮醛對照品溶液的配制采用乙腈溶解。

(2)由于中藥復方制劑藥味組成多,成分比較復雜,且兩種指標或多種指標加權評分可更好地控制中藥制劑的質量。本研究中君藥花椒在2015年版《中華人民共和國藥典》標準中無含量測定方法,臣藥干姜的有效成分6-姜辣素,預實驗采用多種流動相及制樣方法測定,陰性均有干擾。因此,椒桂酊的提取工藝研究采用桂皮醛含量及總固體量兩種指標進行綜合評價。最終優選出最佳提取工藝為加6倍量的70%乙醇浸漬14d,通過驗證試驗亦證明了工藝穩定可行,因此,本研究可為椒桂酊規模生產提供參考。