正交試驗法優選參芪益氣口服液提取工藝

李 萍,韋祖巧,曾 金,肖 萍,歐人豪

(柳州市婦幼保健院;廣西科技大學附屬婦產醫院、兒童醫院,廣西 柳州545001)

我國每年有2 000多萬產婦,約有70%存在著不同程度的產褥期縮復不良的情況[1]。超過70%的調查對象自報至少存在1種健康問題[2]。現代中醫學通過研究顯示,產后益氣補血可以不同程度緩解和治療婦女產后氣血兩虛的相關癥狀[3-7]。參芪益氣口服液是柳州市婦幼保健院在研制劑,由黃芪、黨參、當歸、熟地黃等11味中藥組成,主要用于婦女產后益氣消炎,提高產婦免疫力,預防產后病等。方中黃芪補中益氣、升陽固表,黨參健脾益氣、養血補氣,為君藥;當歸血和營,助黃芪、黨參益氣生血,為臣藥;山藥、黃精平補肺脾腎三經,又能益氣養陰,氣陰雙補,同為臣藥;山銀花清熱解毒、宣表透邪、芳香避穢為佐藥,甘草益氣和中,調和諸藥。參芪益氣口服液是在我院中醫專家多年臨床經驗的基礎上,辨證施治總結出的有效方劑,通過益氣補中,治療婦女產后由氣血兩虛引起的產后氣虛、盜汗、排尿困難等癥,且該方在臨床應用過程中發現可減少抗生素的使用。現代藥理研究表明,黃芪能增強機體免疫功能,抑制炎癥因子的分泌,還具有一定的抗菌作用[8]。黨參具有免疫調節作用,可提高體液免疫功能[9]。

本研究采用正交試驗法篩選參芪益氣口服液中的11味藥材的水提取工藝,以有效成分綠原酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷和阿魏酸為主要指標測定含量,優選該制劑的最佳提取工藝,為該制劑的生產提供理論依據。

1 實驗材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀(型號LC-20AT,日本島津);電子分析天秤(型號FA1004,上海天平儀器廠);數控超聲波清洗器(型號KQ-300DB,昆山市超聲儀器有限公司);臺式低速離心機(型號TDZ4-WS,湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)。

1.2 試藥

毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品(批號:111920-201606)、綠原酸對照品(批號:110753-201716)、阿魏酸對照品(批號:110773-201614)均購自中國食品藥品檢定研究院;參芪益氣口服液樣品由柳州市婦幼保健院藥劑科制劑室提供;流動相用甲醇、乙腈為色譜純,其他試劑均為分析純,水為純化水。

2 方法與結果

2.1 綠原酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷和阿魏酸含量測定

2.1.1 色譜條件 采用Agilent HC-C18(250 mm×4.6mm,5μm)色譜柱,乙腈(A)-0.1%磷酸水(B)溶液為流動相,洗脫梯度(0~10 min,10%~10% A;20~60 min,10%~18%A),流速1.0m L/min,檢測波長綠原酸、毛蕊異黃酮葡萄260nm(0~25min,45~60min),阿魏酸315nm(25~45 min),柱溫30℃,進樣量20μL,檢測時間60min。在此色譜條件下,取“2.1.2”“2.1.3”項下溶液進行測定,所得色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜

2.1.2 對照品溶液制備 分別精密稱取綠原酸、阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品適量,加流動相溶解,制成母液濃度分別為2.008 mg/mL、0.464 mg/mL、0.896 mg/mL。精密量取綠原酸母液8.765 mL,阿魏酸母液0.732 mL、毛蕊異黃酮葡萄糖苷母液0.357mL,流動相定容至25.0 mL,搖勻,即得混合對照品溶液(濃度分別為綠原酸0.704mg/mL、阿魏酸0.013 6 mg/m L、毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.012 8 mg/mL),備用。

2.1.3 供試品溶液制備 精密量取參芪益氣口服液提取原液1.0mL,流動相稀釋定容至10.0mL,振搖,離心(3 600 r/min)5min,上清液用0.45μm微孔濾膜過濾,即得。

2.1.4 線性關系考察 分別精密吸取“2.1.2”項下混合對照品母液0.5 m L、1.0 m L、2.0 m L、3.0 m L、5.0 m L,用流動相定容至5.0 m L,得到系列濃度的混合對照品溶液,進樣分析,記錄峰面積。以峰面積Y對進樣量X(μg)進行線性回歸,得綠原酸的回歸方程為Y=15.586X+15.526(r=0.999 8),線性范圍70.4~704μg;阿魏酸Y=115 379X-18 029(R2=0.999 6),線性范圍1.36~13.6μg;毛蕊異黃酮葡萄糖苷Y=75 598X+4 974.9(R2=0.999 4),線性范圍1.28~12.8μg。表明綠原酸、阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷在一定范圍內線性良好。

2.1.5 精密度試驗 精密吸取參芪益氣口服液樣品(批號20051301),按“2.1.3”項下方法制備供試品,再按“2.1.1”項下色譜條件連續進樣6次,記錄峰面積。結果,綠原酸、阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積的RSD分別為0.86%、0.75%、1.07%,表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩定性試驗 取同一供試品溶液20μL,按“2.1.1”項下色譜條件下分別于0 h、2 h、4 h、6 h、10 h、24 h進樣,記錄峰面積。結果綠原酸、阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、峰面積的RSD分別為1.15%、1.08%、0.61%,表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.1.7 重復性試驗 取同一批樣品,按“2.1.3”項下方法平行制備6個供試品溶液,分別進樣20μL,記錄峰面積,計算綠原酸、阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量。結果綠原酸、阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量的RSD分別為1.47%、1.30%、1.69%,表明該方法的重復性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 取同一批參芪益氣口服液樣品0.5m L,共6份,分別加入0.5m L已知濃度的混合對照品母液(含有綠原酸0.704mg/m L,阿魏酸0.013 6mg/m L,毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.012 8 mg/m L),加流動相定容至10.0 m L,振搖,離心,上清液用0.45μm微孔濾膜過濾,進樣分析,結果綠原酸、阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷的平均回收率分別為99.44%、101.06%、98.00%,RSD分別為2.54%、1.57%、2.09%,表明本方法加樣回收率良好。

2.2 提取工藝優選

本制劑采用正交試驗法,對加水量(A)、提取時間(B)及提取次數(C)3個因素設計L9(3)4正交試驗。因素水平表見表1。

表1 正交因素設計

按處方配比平行稱取黃芪、黨參等11味藥材共9份,根據正交試驗設計的條件進行提取,為提高煎煮效果,藥材加水浸泡1 h后再進行煎煮。將正交試驗得到的提取液過濾、合并、濃縮后,分別測定綠原酸、阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量,并進行多指標綜合分析。

2.3 正交試驗方法與結果

由表2直觀分析可知,根據極差R大小確定影響因素主次為:提取次數>提取時間>加水量;根據K值可知,A2>A3>A1,B2>B3>B1,C2>C3>C1,初步可得最佳提取工藝為A2B2C2。

表2 正交試驗結果

由表3正交試驗結果方差分析可知,加水量(A)、提取時間(B)、提取次數(C)對綜合評分均無顯著性影響,故從省時節能、降低成本和對綜合評分影響大小三方面考慮,選擇A2B1C2因素水平。即最佳提取工藝為加7倍量水,提取2次,每次1h。

表3 正交試驗結果方差分析

2.4 驗證試驗

為確定優選工藝的優劣和穩定性,按照處方量稱取藥材3份,加入7倍量水,浸泡30 min,沸騰后小火煎煮1 h,趁熱過濾。濾渣加入7倍量水煎煮1 h,趁熱過濾,合并兩次濾液,濃縮至100 m L。按“2.1.2”項制備供試品,再按“2.1.3”項下色譜條件測定綠原酸、阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量。由表4結果可見,此工藝穩定可靠,重復性佳,合理可行,可用于參芪益氣口服液的提取制備。

表4 工藝驗證實驗結果 (μg/m L)

3 討論

在前期研究設計時,擬將干浸膏提取率納入評價標準,但在研究過程中發現,其結果對綜合評分影響不大,故未將其排在考察范圍。

由于實驗條件的限制,以及對照品貨源的短缺,故將黃芪中的主要有效成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷、當歸的主要有效成分阿魏酸、山銀花的主要有效成分綠原酸作為含量測定指標,對參芪益氣口服液的水提取工藝進行研究。本組方含11味藥材,成分較復雜,樣品的處理方法對本實驗的結果影響較大,筆者分別用甲醇、50%甲醇、1%鹽酸甲醇、流動相稀釋,使用乙酸乙酯、丙酮等液液萃取法,以及固相萃取法,結果表明使用流動相(乙腈∶0.1%磷酸溶液=1∶9)稀釋操作簡單,得到的目標成分含量高且雜質少。

本實驗通過L9(3)4正交試驗,采用多指標評分法,對參芪益氣口服液的制備工藝進行優選,最后得出其最佳提取工藝為加7倍量水,提取2次,每次1 h。經驗證試驗證實,該方法穩定、可靠。