中藥飲片耐熱微生物研究

張學博 ,郁愛萍,陸春勝

(上海市崇明食品藥品檢驗所,上海202150)

中藥飲片系指中藥材經過炮制后可直接用于中醫臨床或制劑生產使用的處方藥品[1]。中藥炮制是按照中醫藥理論,根據藥材自身性質,以及調劑、制劑和臨床應用的需要,采取的一項獨特制藥技術。炮制方法一般可分為三大類:凈制切制、炮炙(例如炒制、酒炙、蜜炙、制炭、煅、蒸、煮、燉等)和其他(燀、制霜、水飛等)[2]。中藥飲片多為天然植物藥材經凈選、切制或其他炮制方法炮制,不經高溫處理過程,其微生物污染量一般較大;經炮炙的中藥飲片一般均經過高溫處理,其微生物污染量會有所降低。

耐熱微生物是指對高溫具有較強抵抗力的一類微生物[3-5]。《中華人民共和國藥典》2020年版征求意見稿的耐熱菌是指供試品經100℃保溫30 min后存活的微生物。中藥飲片煎煮服用是中醫的特色,經煎煮,一部分微生物被高溫殺滅,但部分耐熱微生物繼續存活。本研究通過對中藥飲片中污染的耐熱菌進行培養計數,并對中藥飲片原材料和耐熱菌培養物進行16Sr DNA基因高通量測序[6-7],分析中藥飲片中耐熱微生物的污染數量和組成,分析潛在的生物危害因子,為中藥飲片微生物的污染風險評估及標準制定提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 樣品信息 麻黃(去節)、桂枝(去皮)、甘草(炙)、杏仁(去皮尖)、白芍藥、大黃(酒洗)、厚樸(炙,去皮)、枳實(大者,炙)、澤瀉、白術,含種子、果實、全草、莖枝、根及根莖類植物藥,基本覆蓋了中藥飲片中較重要的藥用部位。

原料中藥飲片合計30批次,每份樣品不少于100 g,均為市售。編號后綴為“-1”為直接抽提核酸后高通量基因測序用試驗樣品;“-2”為常規培養法試驗樣品,培養物進行擴增后后綴改為“-N”(見表1、表4)。

表1 樣品信息

1.1.2 培養基與試劑 胰酪大豆胨瓊脂培養基(TSA)、沙氏葡萄糖瓊脂培養基(SDA)、p H=7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液均由北京陸橋技術股份有限公司提供;0.9%無菌氯化鈉溶液自配。Phusion超保真DNA聚合酶(NEB公司);DNA Marker(DL9000欣百諾;DL2000Takara);SRBR Premix Ex Taq TM(2×)、細菌基因組DNA小量純化試劑盒(Takara公司),MiSeq Reagent Kits v3(Illumina公司)。

1.1.3 主要儀器 AC2-6S1型生物安全柜(ESCO新加坡),電泳儀和凝膠成像儀(Bio Rad美國),ABI9700智能梯度PCR儀(ABI美國),Axygen凝膠回收試劑盒(Axygen美國),FTC-3000TM real-time PCR(楓嶺上海),Miseq測序儀(Illumina美國)。

2.1 試驗方法

2.2.1 常規培養法 原料中藥飲片的微生物檢測試驗方法參照《中華人民共和國藥典》2020年版《中藥飲片微生物限度檢查法(增訂草案)》操作。

(1)供試液制備。稱取已混合均勻的樣品約25 g,置于含250 mL p H=7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液的已滅菌密蓋容器中,充分蕩洗不少于20min,取其液體作為供試液(1∶10)。

(2)耐熱菌計數。耐熱菌計數:取10 m L上述供試液,100℃水浴30 min處理后迅速冷卻,此供試液及其連續10倍稀釋級的供試液采用胰酪大豆胨瓊脂培養基平板傾注法(1m L/皿),每個稀釋級至少制備2個平板。在30~35℃培養3~5 d。

耐熱菌鑒定:將收集到耐熱菌的培養物采用高通量基因測序試驗法(16Sr DNA測序)進行鑒定。

陰性對照試驗:以p H=7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液代替供試液進行陰性對照試驗,陰性對照試驗應無菌生長。

2.2.2 高通量基因測序試驗法 原料中藥飲片、耐熱菌培養物參考《中華人民共和國藥典》2020年版《9204微生物鑒定指導原則(第一次征求意見稿)》和《細菌DNA特征序列鑒定法(第一次征求意見稿)》進行試驗。

(1)樣品抽提核酸前處理。原料中藥飲片:取6 g加無菌PBS浸沒的供試品,超聲(42 k Hz)1 min,重復2次,將液體倒入無菌4mL離心管中,高速離心(12 000 r/min)5min,棄去上清液,富集物加入2m L無菌PBS,混勻后即為供試液。

培養物樣本:采用0.9%無菌氯化鈉溶液進行平板清洗后收集洗脫液35 m L于滅菌的40 m L離心管中,高速離心(12 000 r/min)5 min,棄去上清液,富集物加入4 m L無菌PBS,混勻后即為供試液。

(2)樣品PCR擴增和產物純化方法。對“2.2.2(1)”項下提取的供試液,采用TAKARA細菌基因組試劑盒提取DNA,作為測序模板。采用兩步PCR擴增方法進行文庫構建。將純化的DNA作為模板,利用16Sr DNAV4-V5區通用引物515F(5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3')和926R(5'-CCGTCAATTCMTTTGAGTTT-3')且含有部分Miseq測序引物的融合引物進行1次20個循環PCR擴增,并用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,檢測效果較好的樣本于2%瓊脂糖凝膠電泳切膠回收,以回收產物為模板進行1次8循環的PCR擴增,將Illumina平臺測序所需的接頭、測序引物、標簽序列添加到目的片段兩端。全部PCR產物采用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)進行回收,并用FTC-3000TM Real-Time PCR儀進行熒光定量,均一化混勻后完成文庫構建,在Illumina MiSeq 2 x 300 bp平臺上完成測序。PCR擴增體系見表2,PCR擴增參數見表3。

表2 PCR擴增體系

表3 PCR擴增參數

(3)測序結果生物信息分析。對測得的原始數據通過barcode分配樣品reads,得到每個樣本的有效序列,采用Trimmomatic軟件,將測序結果末端低質量的序列去掉,根據PE reads之間的overlap關系,采用flash軟件將成對的reads拼接成一條序列,同時采用mothur軟件對序列質量進行質控和過濾,將模糊堿基(ambiguous)、單堿基高重復區(homologous)、過長和過短的序列,以及PCR過程中產生的一些嵌合體去除,從而得到優化序列,之后進行OTU(Operational taxonomic units)聚類(UPARSE software),OTU代表序列與silva 128數據庫比對進行物種信息注釋。基于分類學信息,在門、綱、目、科、屬、種分類水平上進行群落結構統計分析。利用mothur(Version 1.33.3)進行Alpha多樣性分析(Chao、Ace等物種豐富度統計,Shannon、Simpson等物種多樣性統計)、VENN圖,Beta多樣性分析((un)Weighted UniFrac分 析),利 用R語 言(Version 3.2.3)進行Heatmap分析、PCA分析,CCA/RDA分析則采用CANOCO(Version 4.54)。

3 結果與分析

3.1 常規培養法耐熱菌計數結果

本次試驗除大黃(酒)001(YD001)和厚樸(炙)001(YH003)的耐熱菌未檢出外,其余28批次中藥飲片均檢出了耐熱菌,檢出比例為93%。經統計可知,大多數樣品的耐熱菌污染程度介于101~103CFU/g之間(見圖1)。

圖1 不同中藥飲片樣品中污染的耐熱菌計數比較分析

3.2 高通量基因測序試驗法結果

分析方法:采用OTU分析方法,相似性在97%以上歸為一個OTU,進行生物信息統計分析。見圖2。

圖2 測序數量和OUT數量關系

除了第一批大黃(酒)(YD001)和第三批厚樸(炙)(YH003)的耐熱菌(YD001-N、YH003-N)用常規培養法未檢出,以及原料中藥飲片全部批次的麻黃(YM001、YM002、YM003)直接抽提核酸擴增失敗外,其余25批次中藥飲片與其耐熱菌培養物均做了溯源情況分析。

YA002-1與YA002-N(澤瀉002)、YC002-1與YC002-N(甘草002)兩對未能建立對應關系,其余23對均可實現原料中藥材直接提取的微生物DNA與常規培養法的耐熱菌培養物抽提的耐熱菌DNA一一對應的溯源關系(見表4)。

在YA002-N中耐熱菌經鑒定為環狀芽孢桿菌和芽孢桿菌屬微生物占相對豐度比高達0.97,但在YA002-1無對應的溯源關系微生物DNA,在YA002-1的相對豐度比最高的DNA序列是哈氏幽門螺桿菌(Acinetobacter harbinensis)。YC002-N中耐熱菌經鑒定為芽孢桿菌屬微生物占相對豐度比高達0.91,但在YC002-1無對應的溯源關系微生物DNA,在YC002-1的相對豐度比最高的DNA序列是成團泛菌(Pantoeaagglomerans)。

參與本次溯源分析的25批飲片的耐熱菌基本均屬芽孢桿菌屬,且在原飲片包含的微生物中基本均可發現,只是相對豐度差異較大,因耐熱菌為飲片中含有的微生物經加熱處理后經培養所得,其一般芽孢桿菌屬的相對豐度比高達0.90以上,而原料中藥飲片直接抽提的微生物DNA中尚包含其他所有的微生物基因,故兩者之間的相對豐度比已不具備可比性。

除了芽孢桿菌屬外,在YA001-1與YA001-N(澤瀉001)、YA003-1與YA003-N(澤瀉003)、YB002-1與YB002-N(白芍002)、YH001-1與YH001-N(厚樸001)四對中相互匹配的是產氮假單胞菌(Pseudomonas azotoformans),尤其是澤瀉001和003只有該微生物形成匹配關系;在YD002-1與YD002-N(大黃002)中相互匹配的只有葉桿菌屬(Phyllobacterium)和Aliihoeflea(根瘤菌屬)這2種微生物。

在這25批次直接抽提的原料中藥飲片中,3批的白術(YV001-1、YV002-1、YV003-1)微生物基因中芽孢桿菌屬的相對豐度比均達0.47~0.55,3批枳實(YZ001-1、YZ002-1、YZ003-1)微生物基因中芽孢桿菌屬的相對豐度比為0.05~0.34。這種情況較為少見,說明耐熱性極好的芽孢桿菌屬對原料中藥飲片的污染情況在部分品種中十分嚴重(見表4)。

表4 中藥飲片直接提取與耐熱菌培養物污染微生物屬水平相對豐度

3.3 原料中藥飲片微生物間關聯性分析

分析本研究的10種中藥飲片的耐熱菌數污染情況后,發現不同種類的中藥飲片污染的耐熱菌量有顯著性差異。桂枝和杏仁中的耐熱菌數量遠高于其他飲片品種,其平均污染量大于103CFU/g;麻黃、白術、大黃、厚樸的耐熱菌數量較低,可以看出炮炙類加熱型的炮制工藝殺滅微生物作用很好;原料中藥飲片若本身具有抑制微生物生長功效的各種化學成分,亦可大幅度減少微生物污染種類及數量。

同一種類飲片的不同批次或來源的樣品,耐熱菌數量也存在較大差異。在枳實(炙)和杏仁中,不同批次樣品的耐熱菌污染量差異較大,最低污染量<10 CFU/g,而最高可達103CFU/g。這說明微生物的污染量與中藥飲片的種類沒有絕對聯系,而取決于微生物污染的種類、方式與機制。

3.4 原料中藥飲片微生物DNA直接抽提情況

原料中藥飲片中3批麻黃微生物DNA直接提取全部失敗。可能原因是本身基質干擾,麻黃自身化學成分對PCR擴增可能有抑制作用,其特殊的植物基因組DNA降低了16Sr DNA的擴增效率和特異性。

4 結論

16SrDNA基因高通量測序技術具有較高的靈敏度,可以分析復雜樣本,無需經過微生物分離純化的步驟即可進行鑒定,可較好地應用于中藥飲片耐熱微生物的鑒定[8]。但由于測序長度限制,部分微生物僅能鑒定到屬水平,若要進一步確定則須借助其他方法。

中藥飲片污染耐熱菌的情況普遍存在,主要為芽孢桿菌屬,這些耐熱菌經高溫煎煮也無法殺滅。目前,中藥飲片包裝一般非常簡陋,貯存和運輸過程中無法隔絕微生物再次污染。盡管暫未發現高致病性微生物,但當中藥飲片中耐熱菌污染量達到一定量級后將成為明顯的安全隱患[9-11]。因此,必須進一步完善中藥飲片的微生物限度標準,嚴格控制產品中的致病菌,加強生產、流通和使用等環節的監管,以確保用藥安全。