川芎藥材與飲片指紋圖譜對比研究

2021-12-27 12:10:56瞿昊宇謝夢洲陳光宇

亞太傳統醫藥 2021年11期

瞿昊宇,何群,謝夢洲,3,4,5,陳光宇,3,4,5*

(1.湖南中醫藥大學信息科學與工程學院;2.湖南中醫藥大學湖南省藥食同源功能性食品工程技術研究中心;3.湖南中醫藥大學中醫診斷學湖南省重點實驗室;4.湖南中醫藥大學中醫心肺病證辨證與藥膳食療重點研究室;5.湖南中醫藥大學中醫學院,湖南長沙410208)

川芎為傘形科植物川芎Ligusticum chuanxiongHort.的干燥根莖,主產于四川省彭州、都江堰等地,為四川道地藥材(道地藥材是指具有特定產區、貨真質優的中藥材)。川芎功能與主治為活血行氣、祛風止痛,用于胸痹心痛、胸脅刺痛、跌撲腫痛、月經不調、經閉痛經、癥瘕腹痛、頭痛、風濕痹痛[1],為歷版《中華人民共和國藥典》收載(如2015版《中華人民共和國藥典》一部40-41頁),經炮制后以飲片入藥。現代化學和藥理研究表明,川芎的活性成分主要包括揮發油、酚酸類、生物堿類和內酯類等,其中,阿魏酸是川芎中重要的活性成分,是評價川芎質量的重要標準之一[2]。現已發現阿魏酸具有抗動脈粥樣硬化,抗血小板凝集和血栓,清除亞硝酸鹽、氧自由基、過氧化亞硝基,以及抗菌消炎、抗腫瘤、抗突變、增強免疫功能等作用[3]。早期曾從國產川芎分離出有特殊氣味、易揮發的油狀生物堿、阿魏酸、酚性物質和揮發油等,近年來,對川芎化學成分的研究比較深入,已分離鑒定出了260余種成分[4]。作為臨床常用中藥,有關川芎化學成分的研究較多,國內外均有大量研究報道[5]。一般認為,川芎經炮制后,質變酥脆,利于粉碎和有效成分煎出。2015版《中華人民共和國藥典》一部“川芎藥材及飲片”項下規定了性狀、鑒別、檢查、浸出物、含量測定,未規定指紋圖譜檢測。但僅從已有的檢測項目(如浸出物、阿魏酸含量等)無法全面控制川芎藥材質量,研究其單體成分并不能洞悉川芎功效的全貌,不能全面反映川芎炮制前后質量屬性的改變,從而影響川芎藥材及飲片質量控制及質量評價。目前,國內外已有相關文獻報道川芎藥材或飲片的指紋圖譜研究,但其方法未被藥典收載。且其指紋圖譜未對原料來源進行聚類分析,對于量質傳遞研究還缺乏依據。本研究基于液相色譜法,對文獻報道的川芎指紋圖譜研究進行驗證,為藥典收載方法提供重現性依據。根據指紋圖譜驗證實驗結果,對川芎指紋圖譜峰進行辨認,為川芎藥材-飲片量值傳遞提供實驗依據。

1 儀器與藥材

1.1 儀器

Ultimate 3000高效液相色譜系統(賽默飛世爾科技(中國)有限公司;包括G1316A四元梯度泵,G1313A標準型自動進樣器,G1316A恒溫箱,G1314A紫外檢測器,Agilent Chemstation色譜工作站);中文液晶臺式超聲波清洗器(昆山美美超聲儀器有限公司);ME204E型電子分析天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司);TCS-100型電子臺秤(上海乾峰電子儀器有限公司);PW135型中草藥粉碎機(天津泰斯特儀器有限公司);SHH.W21電子三用水箱(北京中興偉業儀器有限公司);QY-1中藥切片機(溫州頂歷醫療器械有限公司);101-0AB型電熱鼓風干燥箱(北京中興偉業儀器有限公司)。

1.2 藥材及試劑

各產地、批號的川芎藥材經湖南中醫藥大學王智老師鑒定為川芎Ligusticum chuanxiongHort.的干燥根莖;阿魏酸對照品(批號:110773-201614),購自中國食品藥品檢定研究院(國家藥品標準物質),供含量測定用(不少于99.0%50 mg);甲醇、乙腈為色譜純,水為重蒸餾水;液相色譜柱(月旭公司Ultimate?XB-C18型,5μm,4.6mm×250mm)。

2 實驗方法與結果

2.1 川芎藥材指紋圖譜測定方法

2.1.1 色譜條件與系統適用性試驗[1-6]液相色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑,以甲醇(A)-0.1%磷酸水溶液(B)為流動相;梯度洗脫(0~10 min,15%→30%A;10~20 min,30%→50%A;20~40 min,50%→70%A;40~45min,70%A;45~55 min,70%→100%A;50~60 min,100%A;60~65min,100%→15%A;65~70 min,15%A)流速:0.8 m L·min-1,檢測波長為270nm,柱溫:30℃,進樣量:10μL,理論板數按阿魏酸峰計算應不低于2 000。

2.1.2 阿魏酸對照品溶液制備取阿魏酸約10mg,精密稱定,置于10 m L棕色容量瓶中,精密加入70%甲醇定容至刻度,搖勻,制成每1m L含阿魏酸1.13mg的阿魏酸對照品濃溶液1,精密移取1 m L阿魏酸對照品濃溶液1置10 m L棕色容量瓶中,加70%甲醇定容至刻度,搖勻,制成每1 m L含阿魏酸0.113mg的對照品濃溶液2,精密移取2 m L阿魏酸對照品濃溶液2于10 m L棕色容量瓶中,加70%甲醇定容至刻度,搖勻,制成每1 m L含阿魏酸22.6μg的對照品溶液,過0.22μm微孔濾膜至進樣小瓶中,即得。

2.1.3 供試品溶液制備基本方法取川芎粉末(過四號篩)約0.5 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入70%甲醇50m L,密塞,稱定重量,置超聲波提取器中超聲60 min(200 W,50 Hz),放冷,再稱定重量,用70%甲醇補足減失的重量,搖勻,靜置,取10 m L上清液離心7 min,取上清液,過0.22μm的微孔濾膜至進樣小瓶中,即得供試品溶液。

2.1.4 陰性對照供試品溶液的制備取缺川芎藥材的樣品,按“2.1.3”法同法制備,即得陰性供試品溶液。

2.2 方法學考察[7-10]

2.2.1 精密度試驗取同一供試品溶液,連續進樣6次,檢測指紋圖譜峰,各共有峰相對保留時間與峰面積比值大體一致,阿魏酸色譜峰面積RSD=1.382%(n=6),表明儀器精密度良好。

2.2.2 重復性試驗取同一批樣品6份,按供試品溶液的制備法制備成供試品溶液,按“2.1.1”項下色譜條件分別進樣,測定其色譜圖,各共有峰相對保留時間與峰面積比值大體一致,阿魏酸色譜峰面積RSD=2.272%(n=6),表明本分析方法重復性良好。

2.2.3 穩定性試驗取同一供試品溶液,分別于0、4、8、12、24、48 h進樣,測定其HPLC譜圖,各共有峰相對保留時間和峰面積比值基本一致,阿魏酸色譜峰面積RSD=2.772%(n=6),表明本分析方法穩定性良好,供試液在48h內穩定。

2.3 川芎藥材及飲片指紋圖譜建立

根據CX-02、06、07、08、09、17、20、21、22、23、24、25、26、29、30等15批次川芎藥材及飲片色譜圖,參照文獻報道方法進行匹配,15批藥材指紋圖譜見圖1,15批飲片指紋圖譜見圖2,生成的川芎藥材對照特征圖譜見圖3,川芎飲片對照特征圖譜見圖4。陰性對照品溶液(甲醇空白)見圖5,阿魏酸對照品溶液見圖6,川芎藥材供試液指紋圖譜見圖7,川芎飲片供試液指紋圖譜見圖8,各批藥材供試品對照特征圖譜相似度見表1。各批飲片供試品對照特征圖譜相似度見表2。