桃核承氣湯對慢性腎衰竭大鼠的調控機制研究

張喜奎,王巧花,王旭麗,李靈輝,朱為坤

(1.福建中醫藥大學附屬第二人民醫院,福建 福州350003;2.福建中醫藥大學,福建 福州350122)

慢性腎衰竭(Chronic renal failure,CRF)指各慢性腎臟疾病進展至終末階段而出現的臨床綜合征[1]。中醫古籍中并無“慢性腎衰竭”這一病名,但根據其病機特點及臨床特征,可將其歸屬于“關格”“腎勞”“水腫”“癃閉”等范疇。CRF病機錯綜復雜,病性多為本虛標實、虛實夾雜,常以脾腎虧虛為致病之本,濁毒瘀血內阻、三焦不利為致病之標。虛實互見、寒熱錯雜是其重要病理特點,瘀血濁毒內阻貫穿病變過程的始終[2]。桃核承氣湯具有活血化瘀、通腑瀉濁的功效,臨床及實驗研究均證實其為治療CRF的有效方劑[3-5]。

慢性腎衰竭的發生受到多種細胞因子和分子因素的調節,病變機制復雜,其主要病理基礎是腎纖維化。研究表明,Wnt/β-catenin信號通路的異常激活是腎纖維化發生發展的重要因素。β-連環蛋白(β-catenin)、結腸腺瘤息肉蛋白(APC)和T細胞因子4(TCF4)是Wnt/β-catenin信號通路的重要因子,在腎纖維化過程中起著重要作用,已被證實與慢性腎衰竭的發生關系密切。本實驗用桃核承氣湯干預CRF模型大鼠,綜合大鼠一般情況、貧血指標、腎功能、腎組織形態以及β-catenin、APC及TCF4的mRNA和蛋白表達情況,以期探討桃核承氣湯對慢性腎衰竭大鼠的調控機制。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

從上海斯萊克實驗動物有限責任公司(許可證號:SCXK(滬)2012-0002)采購125只7周齡雄性,體質量約在200g左右的Wistar大鼠,飼養于福建中醫藥大學實驗動物中心。適應性飼養1周后開始實驗。

1.2 實驗藥物與試劑

桃核承氣湯飲片:桃仁12g、生大黃12g(后入)、芒硝6g(沖服)、桂枝6g、炙甘草6 g,購自福建中醫藥大學附屬第二人民醫院,煎煮并濃縮成42 g/100 m L的中藥液,分裝至EP管,保存于4℃冰箱備用。內蒙古康臣藥業無糖型尿毒清顆粒(國藥準字:Z20073256)與加熱后的超純水配成25%的溶液。

注射用青霉素鈉(魯抗制藥,國藥準字:H37020079);APC抗體(Abcam公司,英國,批號:ab40778);β-catenin抗體(三鷹生物技術有限公司,武漢,批號:51067-2-AP);TCF-4抗體(Abcam公司,英國,批號:ab76151);β-actin抗體(三鷹生物技術有限公司,武漢,批號:66009-1-Ig);逆轉錄試劑盒(Vazyme生物科技有限公司,南京,批號:R123-01);PCR試劑盒(Vazyme生物科技有限公司,南京,批號:Q311-02);PBS磷酸鹽干粉(Solarbio科技有限公司,北京,批號:AR0030)。

1.3 實驗儀器

低溫高速離心機(Eppendorf公司,德國,型號:5424R);血液分析儀(SYSMEX公司,日本,型號:XT-2000iV);生化分析儀(Beckman公司,美國,型號:AU5800);實時熒光定量PCR儀(ABI公司,美國,型號:ABI7500);電泳儀(Bio-Rad公司,美國,型號:POWER PAC3000);光學顯微鏡(Zeiss公司,德國,型號:Axio Scope.A1);超薄切片機(Leica公司,德國,型號:UC-6型);透射電子顯微鏡(日立公司,日本,型號:H-7650型);電鏡圖像采集分析系統(SIS公司,德國,型號:VELETA型)。

2 實驗方法

2.1 分組與造模方法

先將125只Wistar大鼠以隨機的方式各抽取25只大鼠作為空白組和假手術組,其中空白組不做手術干預,假手術組僅行手術剝離雙腎被膜;余下的75只大鼠參照文獻[4]5/6腎切除方法建立CRF大鼠模型:即先切除左側2/3腎臟,1周后再結扎并剪除右側腎臟。術后第3周采血檢測Scr水平檢測造模是否成功,確認造模成功后再隨機分成模型組、尿毒清組以及桃核承氣湯組各25只大鼠。

2.2 干預方法

術后第4周開始對各組大鼠進行藥物灌胃干預。參照實驗動物常規換算法,大鼠每公斤體重的用藥劑量參照標準成人每公斤體重用量的6倍[5],除桃核承氣湯組和尿毒清組分別予桃核承氣湯、尿毒清顆粒混懸液10 m L/(kg·d)灌胃外,余下3組大鼠則予等劑量生理鹽水灌胃,灌胃時間為56 d。

2.3 觀察指標及方法

2.3.1 大鼠一般情況觀察 觀察并記錄大鼠體型體態、活動情況、應激反應、飲食、二便及體質量變化等一般情況。

2.3.2 腎組織病理形態觀察 灌胃56 d結束后,即予禁食不禁水24 h。各組隨機抽取3只大鼠,在未取血的情況下麻醉大鼠后,暴露左側腎臟,于皮質部分取約1 mm×1 mm×1mm的組織3~4塊,迅速投入3%戊二醛-1.5%多聚甲醛-0.1MPBS和1%鋨酸的溶液中進行雙重固定,經乙醇-丙酮梯度脫水,環氧樹脂包埋,半薄切片定位、超薄切片干燥,電子染色,最后于透射電鏡下觀察腎組織病理形態。

2.3.3 血常規、腎功能檢測 麻醉大鼠后迅速打開腹腔,抽取腹主動脈血液運用血液分析儀和生化分析儀檢測RBC、HB、Scr、BUN含量。

2.3.4 qPCR法檢測 在采集大鼠血液標本后,快速摘取左殘腎,將組織切分后裝入凍存管,放置于-80℃冰箱保存。取100 mg腎組織進行RNA提取,測定濃度后行逆轉錄反應,分別取2μL PCR產物在實時熒光定量基因擴增儀進行qPCR反應。用2-△△Ct表示APC、β-catenin及TCF4相對表達量。引物序列見表1。

表1 腎組織β-catenin、APC、TCF4引物序列

2.3.5 Western blot法檢測 取100 mg腎組織進行蛋白提取,用BCA法測定蛋白濃度;于待測樣本中加入上樣緩沖液,放置金屬浴5 min,待蛋白充分變性;根據蛋白分子量配制SDS-PAGE膠進行電泳分離;經轉膜、封閉后加入一抗、二抗進行孵育;最后在PVDF膜上滴入顯影液,放入顯影儀中曝光成像,用Image Lab軟件分析腎組織中β-catenin、APC及TCF4的蛋白表達。

2.4 統計學方法

將實驗所得數據用統計軟件SPSS 25.0進行分析,統計結果用(±s)表示。P<0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 大鼠一般情況

空白組與假手術組大鼠外形及精神狀態良好,體重平穩增長;模型組大鼠體型較瘦,毛色枯槁,爪、尾色淡,反應遲緩,不喜活動,進食減少,大便質稀,個別大鼠存在“腹水”情況,體重增長緩慢;桃核承氣湯組大鼠體型偏瘦,毛色偏暗,活動靈敏度一般,食量減少,糞質較稀,體重增長較慢;尿毒清組大鼠一般情況介于模型組與桃核承氣湯組之間。各組大鼠體質量變化見表2、圖1。

圖1 各組大鼠體質量變化趨勢

表2 灌胃前后各組大鼠體質量變化(n=17~25±s,g)

表2 灌胃前后各組大鼠體質量變化(n=17~25±s,g)

注:與空白組比較,*P<0.05;與模型組比較,△P<0.05;與尿毒清組比較,▲P<0.05。

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3.2 腎組織病理形態觀察

如圖2所示,正常組及假手術組大鼠腎組織形態正常,細胞結構鏡下清晰可見,排列緊密規則。模型組大鼠細胞

圖2 電鏡下各組大鼠左腎組織形態(×10 000)

核固縮變形,部分溶解,細胞邊緣不光滑,可見線粒體空泡,線粒體嵴模糊;腎小球內皮細胞和上皮細胞增生水腫,基底膜明顯增厚,足突大面積融合;腎小管細胞形態排列紊亂,局部系膜基質增生,可見炎細胞浸潤,絨毛脫落、消失。尿毒清組整體情況較模型組有所改善,可見脂質空泡,基底膜稍有增厚,足突部分融合,部分線粒體完整,可見明顯的線粒體嵴。桃核承氣湯組大鼠細胞結構相對完整,雙層細胞核膜明顯,細胞質中多數線粒體結構完整,可見線粒體脊;腎小球內皮細胞排列較為整齊,基底膜局部可見增厚,足突部分融合;腎小管上皮細胞排列紊亂,絨毛少量脫落。

3.3 貧血指標、腎功能檢測結果

從各組大鼠RBC、Hb的實驗結果來看,空白組與假手術組比較差異無統計學意義(P>0.05);尿毒清組與桃核承氣湯組兩組結果均低于空白組,但均較模型組升高,差異有統計學意義(P<0.05);尿毒清組與桃核承氣湯組比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見表3、圖3、圖4。

表3 大鼠紅細胞、血紅蛋白實驗結果比較(±s)

表3 大鼠紅細胞、血紅蛋白實驗結果比較(±s)

注:與空白組比較,*P<0.05;與模型組比較,△P<0.05;與尿毒清組比較,▲P>0.05。

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圖3 各組大鼠RBC含量

圖4 各組大鼠Hb含量

從各組大鼠Scr、BUN的實驗結果看,空白組與假手術組比較差異無統計學意義(P>0.05);尿毒清組與桃核承氣湯組結果均高于空白組,但均較模型組降低,差異有統計學意義(P<0.05);桃核承氣湯組結果相對尿毒清組降低,差異有統計學意義(P<0.05)。見表4、圖5、圖6。

表4 各組大鼠血肌酐、尿素氮的實驗結果比較(±s)

表4 各組大鼠血肌酐、尿素氮的實驗結果比較(±s)

注:與空白組比較,*P<0.05;與模型組比較,△P<0.05;與尿毒清組比較,▲P<0.05。

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圖5 各組大鼠Scr含量

圖6 各組大鼠BUN含量

3.4 實時熒光定量PCR檢測結果

如圖7所示,空白組 與假 手術組APC、β-catenin和TCF4的mRNA表達水平無顯著差異;桃核承氣湯組APC的mRNA表達水平相對空白組降低(P<0.05),但較模型組和尿毒清組升高(P<0.05);桃核承氣湯組β-catenin、TCF4的mRNA表達水平相對空白組升高(P<0.05);但較模型組與尿毒清組降低(P<0.05)。

圖7 各組大鼠腎組織中APC、β-catenin、TCF4mRNA表達結果

3.5 Western Blot檢測結果

如圖8所示,空白組與假手術組APC、β-catenin和TCF4蛋白表達水平無顯著差異;桃核承氣湯組APC的蛋白表達水平較空白組降低,但高于模型組和尿毒清組;桃核承氣湯組β-catenin、TCF4的蛋白表達水平較空白組升高,但低于模型組與尿毒清組。

圖8 各組大鼠腎組織中APC、β-catenin、TCF4蛋白表達結果

4 討論

慢性腎衰是多種慢性腎臟疾病的終末階段,以腎臟結構被破壞、腎小球濾過率降低、腎功能嚴重受損、體內代謝產物潴留及酸堿平衡紊亂為主要病理表現。據流行病學調查顯示,目前我國慢性腎臟病的發病率約為10.8%,其中每年約有數十萬例進展為CRF[6]。現代醫學治療CRF早中期主要針對原發病采取對癥治療,而到中后期則多是利用透析療法以維持生命,但這些治療方法存在著諸如費用高昂、感染率高、副作用顯著等弊端。中醫在改善CRF相關臨床癥狀、預防和治療并發癥發面均突顯其優勢。尋找有效抗腎纖維化的中藥及方劑,探討其具體作用機制,有助于預防和延緩CRF進展。

慢性腎衰竭多是以瘀血濁毒貫穿病變過程的始終,因此CRF治療應以逐瘀泄濁為主,通過祛除瘀血濁毒,給邪氣以出路,使邪卻則正復。桃核承氣湯出自張仲景《傷寒論》,該方原主邪熱與瘀血互結下焦所致之蓄血證,具有瀉下瘀血、祛除濁毒的功效,與CRF病機、臨床表現相吻合。尿毒清顆粒是臨床上治療CRF使用較為廣泛的中藥復合制劑,具有通腑降濁、健脾祛濕、活血化瘀的作用,臨床療效肯定,故將其作為本實驗陽性對照藥。

本實驗研究發現,CRF模型組大鼠精神狀態較差,體型較瘦,毛色枯槁,爪、尾色淡,反應遲緩,不喜活動,進食減少,大便質稀,個別大鼠存在“腹水”情況,體質量增長緩慢,甚至出現體質量下降。且病理觀察發現腎組織細胞結構不完整,炎性細胞浸潤,細胞外基質增多,腎間質纖維化明顯,較為符合中醫慢性腎衰竭的生物學特征,提示成功建立CRF大鼠模型。

CRF病變機制復雜,其中腎纖維化是其主要病理基礎,腎纖維化的發生和持續加重可能涉及到炎癥反應和多種細胞因子和分子因素的表達異常,在此基礎上導致細胞外基質產生增多及沉積過度是腎纖維化形成的重要分子基礎[7]。Wnt/β-catenin信號通路異常激活、傳導與腎纖維化的發生關系密切。腎損傷時會激活Wnt通路,引發下游多種腎纖維化相關靶基因的異常表達,從而導致腎單位持續性、不可逆性損傷[8]。β-catenin表達升高是導致腎纖維化的重要因素,當Wnt信號通路異常激活時,游離態的β-catenin會進入細胞核,與核內的TCF/LEF的氨基末端結合,共同參與調控Wnt通路介導的腎纖維化轉錄[9]。APC作為降解β-catenin的多蛋白復合體的重要組分,通過磷酸化控制β-catenin向細胞核轉移,是Wnt信號通路的重要抑制因子[10]。

本實驗結果顯示,模型組大鼠腎組織中APC的mRNA和蛋白相對空白組和假手術組呈低表達,而β-catenin、TCF4的mRNA和蛋白含量則呈高表達,這與既往相關文獻[11]報道結果一致。經灌胃干預后,桃核承氣湯組大鼠的一般情況、血常規和腎功能、腎臟病變組織修復方面均較模型組明顯改善,且該組APC的mRNA和蛋白表達含量升高,而β-catenin、TCF4表達均下降。因此認為,桃核承氣湯可能是通過上調Wnt信號通路中APC的表達、下調β-catenin、TCF4的表達水平,減少細胞外基質的過度生成,抑制腎纖維化進展,從而達到治療CRF的目的。

綜上所述,桃核承氣湯治療CRF的作用機制可能與上調APC表達、下調β-catenin及TCF4的表達以抑制Wnt/βcatenin通路活性,改善貧血狀態和腎功能,減輕和修復腎纖維化有關,但其具體調控機制還有待深入研究。