烙灸療法通過Fas/FasL信號通路對髓核細胞凋亡的調節機制

馬蘭潔,楊忠明,許建峰,田 良,林瑞珠,童 昕,孫博文,尤 娜,李國豪

(1.寧夏醫科大學 中醫學院,寧夏 銀川750004;2.寧夏醫科大學總醫院,寧夏 銀川750004;3.寧夏醫科大學 回醫藥現代化教育部重點實驗室,寧夏 銀川750004)

腰椎間盤突出后髓核重吸收(Resorption of herniated lumbar discs,RHLD)是指在沒有外科手術或化學藥物注射干預下通過保守治療出現的自然吸收甚至完全消失的現象[1]。RHLD理論給中醫藥等保守療法防治腰椎間盤突出癥帶來新的啟示[2-3]。

我們前期實驗發現:烙灸療法不僅可以促進大鼠RHLD模型椎間盤的重吸收,促使突出髓核細胞的凋亡,還可以導致髓核組織中IL-1和Caspase-3的高表達。由此我們提出烙灸療法可能是通過介導Fas/FasL信號通路促進腰椎間盤突出后髓核重吸收的假說。因此,本研究旨在闡明烙灸療法通過Fas/Fas L信號通路對髓核細胞凋亡的調節機制,進一步探討烙灸對腰椎間盤突出后髓核重吸收具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 選擇健康Sprague-dawley(SD)大鼠120只,雄性,體重300g,寧夏醫科大學動物中心提供,動物飼養于寧夏醫科大學實驗動物中心。動物合格證號:SCXK(寧)2011-0001。標準條件下飼養,每日自由攝取純水和標準飼料飼養。實驗前喂養5天以適應環境,經觀察無異常后,按體重由輕到重進行編號(1~120號),然后采用SPSS 17.0統計軟件包將大鼠隨機分成4組:烙灸組、拮抗劑組、模型對照組和空白對照組每組各30只。除空白對照組30只大鼠以外,其余90只大鼠按腰椎間盤突出后髓核重吸收造模。

1.1.2 實驗試劑 TUNEL試劑盒、DAB顯色試劑、蘇木素染液、蘇木素分化液、蘇木素返藍液、PBS緩沖液、蛋白酶K、破膜液均購于Servicebio公司;無水乙醇、中性樹膠購于國藥集團化學試劑有限公司;二甲苯購于上海凌峰化學試劑有限公司。

1.1.3 實驗設備 組化筆、載玻片、掌上離心機、脫色搖床、渦旋混合器均購于Servicebio公司;脫水機購于DIAPATH公司;包埋機、凍臺購于武漢俊杰電子有限公司;病理切片機購于上海徠卡儀器有限公司;組織攤片機購于金華市科迪儀器設備有限公司;移液槍購于Dragon公司;顯微鏡、成像系統購于日本尼康公司;灸法所用艾絨購于寧夏醫藥公司[豫鄭食藥監械(準)字2012第1270003號]。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物造模 (1)尾椎切除:采用公認尾椎椎間盤腰椎硬膜外埋置的造模方法,烙灸組、拮抗劑組和模型對照組90只SD大鼠,20%烏拉坦(1 mL/100 g)經腹腔行注射麻醉,麻醉成功后,剃除尾部體毛,用橡皮筋扎住大鼠尾部,并進行常規消毒。無菌條件下,每只大鼠均切取包括2個完整間盤長度的尾椎,需包含上下軟骨終板。用針刺破上下終板,使髓核暴露,造成游離狀態或破裂狀態。用7號手術線進行“米”字形包繞,切取尾椎后放入生理鹽水器皿中備用。

(2)腰椎造模:大鼠腰椎的皮膚剃毛后常規消毒,無菌條件下沿后正中線后路切開背部皮膚、皮下組織及腰背筋膜,沿棘突剝離骶棘肌,用縫合線分開肌肉組織暴露腰椎,去掉L2-5椎板,露出腰椎硬膜。將取出的尾椎間盤小心放置在腰椎硬膜外,并取可吸收的明膠海綿貼在移植髓核表面,逐層縫合。烙灸組、拮抗劑組和模型對照組的大鼠從造模1月后進行干預,6月后進行取材。

1.2.2 治療方法 (1)烙灸組:30只大鼠從造模1月后進行干預。固定在固定器上,沿大鼠腰椎縱軸方向進行剃毛,將特制的2 cm×0.5 cm×0.5 cm長方體鐵制灸具以腰椎縱軸方向放置,覆蓋L1-L6椎體表面,將鐵制灸具的中心放置在大鼠L3-L4間隙,然后將灸槽內2 g艾絨點燃,經燃燒的艾絨可以使鐵制灸具發熱,并將熱量向下傳導使局部皮膚出現潮紅,1次/d,每次10min。干預6月后進行取材。

(2)拮抗劑組:30只大鼠從造模1月后進行干預,首先在大鼠腹腔內注射抗Fas抗體,10μg/kg/week,烙灸干預方法同烙灸組,干預6月后進行取材。

(3)模型對照組:30只大鼠造模1月后在固定器上固定10min,每天1次,不予其他干預,固定6月后進行取材。

(4)空白對照組:30只大鼠不予造模和干預,6月后處死并進行取材。

1.2.3 取材 實驗大鼠采用空氣靜脈栓塞法處死,取出埋置在腰椎硬膜外的尾椎椎間盤并剔除周圍軟組織,先行大體觀察并記錄,后用0.9%氯化鈉注射液沖洗,一個放入4%中性甲醛溶液(p H=7.4)中固定1 d,10%EDTA脫鈣3月,梯度酒精脫水,石蠟包埋,常規切片。

1.2.4 TUNEL細胞凋亡檢測 嚴格按照TUNEL試劑盒操作,二甲苯溶液脫蠟清洗,逐級酒精水化;加入蛋白酶K工作液孵育,滴加100μL TUNEL的反應混合物,加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中孵育,滴加二氨基聯苯胺(DAB)顯色液染色,脫水,用蘇木素復染,梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。在熒光顯微鏡下觀察實驗各組的變化情況。

1.2.5 統計學處理 采用SPSS 17.0統計軟件進行大鼠分組和數據分析,采用ONE-ANOVY對TUNEL法檢測的結果進行方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 髓核細胞凋亡的檢測結果

采用髓核細胞的原位末端標記法(TUNEL法)檢測實驗各組尾椎間盤髓核細胞的凋亡情況,空白對照組凋亡指數為0,模型對照組為(20±5),烙灸組為(55±5),拮抗劑組為(30±5),模型對照組、拮抗劑組與烙灸組的髓核細胞凋亡指數明顯高于正常對照組(P<0.05),而烙灸組的髓核細胞凋亡指數高于模型對照組及拮抗劑組(P<0.05)。以上數據提示,烙灸療法可以促進大鼠椎間盤髓核細胞的凋亡。結果見圖1及圖2。

圖1 各組髓核細胞凋亡形態組織學表現

圖2 各模型組間TUNEL陽性細胞數

3 討論

近幾年,腰椎間盤突出癥發病趨于年輕化,長期的久坐久站均會導致疼痛加重,伴有下肢的放射痛,嚴重影響患者的健康,是骨傷科的常見病、多發病。腰椎間盤突出的患者保守治療無效時,唯一的治療方式是手術切除,這將加劇家庭和社會的經濟負擔,同時給患者造成嚴重的心理負擔和身體創傷。而烙灸療法具有活血化瘀、利水消腫的功效,與其他保守治療相比,具有明顯的促進突出的髓核重吸收的作用,從而降低腰間盤突出癥的復發率。烙灸療法是中醫化膿灸的發展與深化,具有刺激面積大、施灸量可控、患者容易接受等優點,在臨床中對腰椎間盤突出后髓核重吸收的療效較為突出。

腰椎間盤突出后髓核重吸收的中醫病因病機為肝腎不足,寒邪、濕邪等六淫侵襲,致氣滯血瘀,不榮則痛,發為腰痛,烙灸療法具有溫陽補腎、溫經散寒、活血化瘀、利水消腫的作用,古代醫家發現艾葉性味辛散,易于走竄,方便熱力穿透肌膚而溫通經絡、祛風散寒、除濕止痛;《本草綱目》中記載艾葉能“溫中,逐冷,除濕”;《名醫別錄》謂其能“主灸百病”。根據“菀陳則除之”“寒者熱之、虛則補之”的治療原則,烙灸施灸量大、熱刺激強烈時可使皮膚破損形成膿瘍,當破潰內“惡潤”流出體外,發揮活血化瘀、利水消腫的功效,以達到治療LDH髓核脫出的目的。髓核脫出組織是一個封閉的無血供組織,具有一定的自身免疫抗原,而當髓核組織游離于椎管內時,在烙灸干預下,促進其充分參與血運,使其更容易發生自身免疫反應,從而產生TNF-a和IL-1β等炎癥因子,以激活Fas/FasL信號通路,誘發髓核細胞凋亡,加速髓核組織降解,促進腰椎間盤突出后髓核重吸收。

腰椎間盤突出后髓核重吸收現象的機制有多種學說,自身免疫、炎性反應、新生血管化、基質代謝平衡失調、椎間盤退變及髓核細胞凋亡等在重吸收的機制中發揮重要作用[4]。椎間盤突出后巨噬細胞浸潤可伴有多種細胞因子釋放,如IL-l、HIF-1、MCP-1等,這些細胞因子可通過多條信號通路(如Fas/FasL、MAPKs、NF-kappa B等)參與到生理活動的調節,并有可能在重吸收中發揮作用[5]。但是,目前認為Fas/Fas L信號通路可能是調控髓核細胞凋亡的重要通路之一,并且艾灸和針刺治療都可以調控該信號通路[5、6]。

Fas又稱Apo-1、CD95或TNFSF6,最初由Yonehara等在一種誘導細胞凋亡的單克隆抗體中發現[7],Park等在腰椎間盤細胞內發現了Fas的表達,且表達程度隨椎間盤突出類型不同而各異[8],目前大部分學者認為,FasL在退變椎間盤中的表達呈下降趨勢,且髓核細胞表達的FasL對椎間盤具有保護作用[9],為Fas信號通路在髓核組織重吸收的研究奠定了重要的基礎。Fas的配體FasL(又稱CD95L、CD178)于1993年由Suda等從細胞毒性T細胞雜交瘤PC60-d10S細胞系中成功克隆[10],其屬于腫瘤壞死因子(TNF)家族,在細胞中主要以膜結合和可溶性兩種方式存在[11]。因此,Fas信號通路是調控細胞凋亡的主要途徑[12,13]。

有研究發現正常髓核組織中僅有Fas L的表達,突出的椎間盤組織中存在FasL、Fas、TNF-a和IL-1的表達,而且表達指數在破裂型組與非破裂型組之間差異有統計學意義[14]。前期研究表明回醫烙灸療法可以增加髓核組織中IL-1和Caspase-3的表達,而IL-1和Caspase-3是Fas/Fas L信號通路上下游重要作用因子[15]。Han等認為,Fas L能通過上調髓核細胞中Fas的表達而促進髓核細胞凋亡,且凋亡與FasL呈劑量依賴性[16]。Fasl與Fas結合后與細胞質連接蛋白的N端死亡域、Fas相關 死 亡 域(FADD)結合,通過半 胱 天 冬 酶 原-8(procaspase-8)的信號接受,最終形成死亡誘導信號復合物(Death-inducing signaling complex,DISC)。在半胱天冬酶-8(caspase-8)的啟動后,激活下游的效應蛋白半胱天冬酶-3(caspase-3),引起蛋白酶水解和相關酶聯反應,從而降解DNA,最終誘導細胞凋亡[17]。

本研究發現烙灸組的髓核細胞凋亡指數高于模型對照組及拮抗劑組(P<0.05),模型對照組的髓核細胞凋亡指數與拮抗劑組相比無明顯差別,不具有統計學意義。說明烙灸療法可以促進大鼠椎間盤髓核細胞的凋亡,從而減輕患者疼痛,提高了腰椎間盤突出癥患者的生活質量,并且烙灸治療簡、便、易、廉,適宜臨床推廣,可節約大量的醫療費用和衛生資源[3]。