液體水溶性肥料中微生物活性保存技術

趙娜娜，李乃薈，陳 清，慕康國

（1. 中國農業大學 資源與環境學院，北京 100193；2. 東北農業大學 園藝園林學院，黑龍江 哈爾濱 150038）

液體水溶性肥料生產成本低、無污染，各養分混合均勻，質量一致，肥效好，受到廣泛關注［1］。為了實現液體水溶性肥料的功能增值，與功能生防菌配伍生產功能性液體水溶性肥料是目前研究熱點。水溶性肥料養分含量高，影響了微生物菌體在液體肥料中的活性，使得微生物水溶肥尤其是養分含量較高的微生物液體水溶肥制備困難［2］。此外，因為在液體環境中，當溫度、溶解氧合適時芽孢類微生物會重新生長，導致活性芽孢的數量減少，并且在肥料生產、保存、運輸過程中微生物易于死亡，嚴重影響了肥料的效果［3-4］。因此，微生物液體水溶肥穩定性差，產品保質期短。

針對微生物液體水溶肥中活菌數少、穩定性差的問題，分析影響液體水溶性肥料微生物活性的因素，綜述目前國內外有關液體水溶性肥料中微生物活性保存技術，希望為延長菌株在水溶性肥料中的存活時間提供理論參考。

1 液體水溶性肥料中微生物活性的影響因素分析

在液體水溶性肥料中微生物活性受多種因素的影響。當生存環境適宜生長時，微生物可以正常地進行代謝、生長、繁殖等活動；當環境不太適宜時，微生物的正常生命活動受到抑制，活菌數量顯著減少。

微生物的生命活動需要大量碳和氮營養元素。碳源可以為細胞合成提供碳架，也能夠提供其進行正常生命活動所需能量，因此碳源是微生物生長、分裂的物質基礎；微生物的原生質主要是蛋白質和核酸，大量的氮營養元素則為其提供原料［5］。微生物菌體的生長和代謝會受到液體水溶性肥料中n（C）/n（N）的影響，合適的n（C）/n（N）能夠為微生物營造一個適宜的生長環境，使其正常生長和代謝。當n（C）/n（N）小于正常值時，會使菌體生長過盛，從而造成菌體的衰老自溶；當n（C）/n（N）高于正常值時，會使菌體生長偏少，導致發酵密度低于預期值，從而使細菌的代謝不平衡。但是只有合適的n（C）/n（N）也不夠，如果碳源和氮源的濃度過低，會影響菌體的正常繁殖；當碳源和氮源的濃度過高時，會影響菌體的發酵過程，使發酵液黏度增加，從而導致溶解氧降低，使菌體的代謝發生異常，進而影響菌體的繁殖和最終產物的合成。

液體水溶性肥料一般鹽濃度較高，而過高的鹽濃度對微生物的菌體具有損害作用。鹽濃度會引起溶液滲透壓變化，當鹽濃度過高時，外滲透壓升高，細菌內水分大量流失，導致微生物脫水；而且微生物吸收營養物質的過程也會受到干擾或阻斷，導致微生物生命活動受到抑制［6］。劉陽等［7］通過基質消耗速率、細胞生長速率、相關代謝產物的生成表現鹽濃度對芽孢桿菌的影響，結果表明鹽濃度過高時，基質中大部分葡萄糖用于代謝產物的合成，而不是菌體生長。

液體水溶性肥料的pH 值會對微生物細胞膜電荷的變化產生影響，從而抑制其對于營養物質的吸收利用［8］。而且，微生物體內的生化反應均是在酶參與下進行的，當pH 值超出酶反應的最適范圍時，會降低其轉化作用；過高的pH 值會使蛋白質和核酸發生水解，從而減少微生物數量［9］。相關研究表明，pH值在6 ～9時較適宜微生物生長。

2 菌株活性保存

2.1 添加保護劑

為了避免液體水溶性肥料中的養分對微生物活性造成影響，可以選擇添加合適的保護劑提高微生物的存活率。保護劑一般分為小分子保護劑（如低聚糖類、緩沖鹽類、氨基酸、醇類及維生素類）和大分子保護劑（如蛋白質、多肽類和多糖類）［10-11］。小分子保護劑可以通過氫鍵或離子基團與細胞蛋白質結合，從而使蛋白質結構與功能保持完整。大分子保護劑在細胞表面形成了保護膜，從而阻止細胞受到損傷［12-13］。保護劑可以在微生物生存環境的pH 值、滲透壓、溫度發生變化時起到緩沖作用，從而保護菌體，避免損傷。因此，在微生物液體肥料中添加保護劑具有易于保存、保持微生物活性、延長肥料貨架期等功效。

聚谷氨酸是指側鏈含有大量羧基基團的一種特殊陰離子高分子聚合物，側鏈的基團賦予其特殊的生物活性，作為一種黏附性物質，聚谷氨酸可為生防菌提供莢膜保護，促使生防菌形成一種外在的包裹生物膜系統，由此隔斷生防菌細胞內外的物質交換，達到一種平衡穩態，使其處于芽孢狀態［14］。馮小海等［15］提出了一種微生物液體菌劑及其制備方法，該微生物菌劑由促生菌菌液、聚谷氨酸和生物有機質組成，生物有機質包括生化黃腐酸、糖蜜和酵母提取物。聚谷氨酸和生物有機質在其中起到相互促進的作用，從而維持了液體菌劑中生防菌的活力，大大延長了微生物液體菌劑的有效期，使菌劑中促生菌的活菌數量在18個月內維持5×109CFU/mL。聚谷氨酸在微生物液體菌劑中為微生物提供莢膜保護，使其處于芽孢狀態。生物有機質則可以在微生物液體菌劑處于包裝狀態時，通過提供高有機質環境和高滲透壓環境抑制芽孢桿菌的芽孢萌發，維持微生物液體菌劑中的促生菌處于芽孢狀態。而當菌劑被稀釋后施用于農作物時，生物有機質濃度降低，隨即改變身份，成為芽孢萌發及微生物增殖的營養成分，為促生菌芽孢萌發提供營養，促進促生菌快速增殖。此外，生物有機質還可以改善土壤結構，緩解土壤板結，解決土壤酸化等問題。周振金等［16］發明了一種液體微生物菌肥，其中加入的5-硝基愈創木酚鈉和聚谷氨酸（γ-PGA）協同使用，一方面可以提高微生物的活性，延長保存時間，另一方面還可以促進植物對營養成分的吸收，提高植物自身的抗性。

海藻糖是一種白色晶體，屬于非還原性雙糖，由2個葡萄糖分子經半縮醛羥基結合生成，其化學性質穩定，是安全的天然糖類。海藻糖可以強力地束縛水分子的運動，并與膜脂質共同擁有結合水或直接代替膜結合水，因此可以防止生物體膜與膜蛋白的變性。海藻糖具有非還原性，可以存在于高溫、酸堿等環境中，因此它可在生物體內起到脫水效果，于高鹽堿、寒冷、干旱等不適宜生存的條件下保護生物膜［17］。在液體水溶性肥料中添加一定量的海藻糖，可有效保持微生物性能，在保證有效微生物含量的前提下，大大延長微生物液體菌劑的保存時間。GOPI 等比較了在液體肥料中分別添加2%甘油、2%聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、0.015 mol/L海藻糖、1%甘油+1%PVP、甘油（2%）+海藻糖（1%）+酵母提取物（1%）+PVP（1%）+脯氨酸（1%）后的活菌數變化情況，研究結果表明，添加海藻糖（0.015 mol/L）的效果最好，18個月后活菌數保持較高數量［18］。

張保安等［19］在研發的微生物液體菌劑中添加保護劑，保護劑由對羥基苯甲酸、吐溫20、海藻糖和維生素C 組成。朱希坤等［20］將吐溫20、黃原膠和甘油組成的保護劑添加入液體菌劑中，在陰涼干燥處常溫保存，保存180 d時菌的存活率為57%，保存360 d 時菌的存活率為26%，保持在較高水平。HE 等［21］比較了添加膨潤土、羧甲基纖維素鈉（CMC）、海藻酸鈉、聚乙烯醇后菌株的活性，研究結果表明，與對照相比所有添加保護劑的處理都能維持活菌的數量，其中添加膨潤土的活菌數最高。膨潤土在完全水合后與水形成膠體，具有良好的吸附和固定細菌性能，因此對細菌具有保護作用。

2.2 添加防腐劑

為了達到穩定活菌數量的目的，還可以在液體肥料中添加山梨酸鉀、苯甲酸鈉等微生物防腐劑。這一類防腐劑可以抑制功能微生物的活性，但對菌體沒有殺滅作用［22］。防腐劑不僅可以抑制功能微生物的活性，減少養分的消耗，而且還可以為功能微生物的生長繁殖提供所需能量，從而延長菌液中微生物的存活時間，提高肥效。

鄧祖科等［23］研發的全營養液體微生物肥，其中微生物防腐劑（丙三醇、麥芽低聚糖、海藻丙二醇脂、糖蜜、異麥芽低聚糖和苯甲酸鈉中的一種或多種）添加量為5%～10%，可以有效地延長菌的存活時間。林斌等［24］研究發現，在制備的微生物液體菌肥中添加乙酸可以使微生物液體菌肥在常溫下貯藏3個月內菌的存活率基本保持穩定，且用甲酸、檸檬酸替換乙酸可以收到同樣的效果。因此，在制備微生物液體菌肥時，添加有機酸對保持菌肥芽孢桿菌存活率、提高液體菌肥的貯藏穩定性至關重要。

2.3 其他

劉文等［25］研發的一種保質期長的復合微生物液體菌劑，其特點在于復合微生物液體菌劑是好氧菌群與厭氧菌群復合而成的微生物液體菌劑，好氧菌及兼性好氧菌在好氧發酵階段進行單獨培養，可在保證菌種純度和功能性的前提下，促進好氧菌快速繁殖。好氧發酵完成后，液體好氧菌劑按比例混入厭氧發酵的菌劑中，好氧菌群受到厭氧菌群及弱酸條件的抑制，繁殖變得緩慢下來，多數菌株形成了芽孢，菌株活力得到保持并暫時處于休眠狀態。而菌株養分與代謝能又得到了互補，菌群間形成了依存共生、互不拮抗的優良共生環境。因此，該復合微生物液體菌劑保存有效期可以達到1年以上，稀釋后，菌株又能很快恢復生長并發揮作用。

3 總結

為了提高微生物在液體水溶性肥料中的存活率，提高肥料的效果，延長產品貨架期，采取一定的保存措施是必要的。添加防腐劑可以達到穩定活菌數量的目的，但在田間運用時，微生物常常表現出活性不夠。保護劑可以對環境的pH 值、滲透壓、溫度等變化起到緩沖作用，避免微生物生存環境條件的急劇變化，從而保護菌體，避免損傷，使微生物保持較高的存活率和活性。大量實驗表明，液體水溶性肥料中加入保護劑可穩定微生物的活性，不同的保護劑對微生物的保護效果不同，且單一的保護劑并不能滿足對微生物活性保存的要求，因此可以選擇將保護劑按一定配方混合使用。