合并非酒精性脂肪性肝病的慢性乙型肝炎患者HBV復制與脂代謝的相互影響

文夏杰，李桂馨，李 婕，饒慧瑛，賈繼東，魯鳳民，

1 北京大學醫(yī)學部 基礎醫(yī)學院 病原生物學系暨感染病中心，北京 100191；2 北京大學人民醫(yī)院 肝病研究所，北京 100044；3 山東大學附屬省立醫(yī)院 感染性疾病科，濟南 250021；4 首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院 肝病中心，北京 100050

慢性HBV感染是我國病毒性肝炎、肝硬化和肝細胞癌的最常見病因，也是世界性公共衛(wèi)生問題。雖然廣泛的乙型肝炎疫苗接種已使我國的全人群HBsAg陽性率下降至5%～6%，但慢性HBV感染者仍有7000萬之多[1]。隨著生活方式的改變，我國非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)患病率逐年升高，1999年—2018年我國NAFLD總患病率已達29.2%[2]。在部分地區(qū)的慢性乙型肝炎(CHB)患者中，NALFD的患病率已達14%[3]。

目前，HBV與NAFLD之間的相互作用尚不清楚。有研究[4]顯示，HBsAg陽性與NAFLD患病率呈負相關關系，HBV感染人群(HBsAg陽性)的NAFLD患病率明顯低于未感染人群，而HBV既往感染人群(抗-HBc陽性且HBsAg陰性)NAFLD的患病率與未感染人群相比則無明顯變化[5]。而在另外的一些研究[6-7]中未發(fā)現CHB患者與無HBV感染者NAFLD發(fā)生率的差異。因此，進一步明確HBV復制與肝細胞脂代謝的相互作用機制，探究合并NAFLD的CHB患者的病毒復制規(guī)律、脂代謝異常及其對疾病進展的影響，將有助于HBV抗病毒治療、為預防HBV合并NAFLD患者終末期肝病的發(fā)生提供新的思路。

1 HBV病毒復制周期

HBV屬于嗜肝DNA病毒科，其存在形式包括直徑為42 nm的大球形顆粒(Dane顆粒)和直徑為22 nm的管狀顆粒和小球型顆粒。Dane顆粒由包含大(L-HBs)、中(M-HBs)和小(S-HBs)三種表面抗原蛋白的脂質膜包裹HBV核心蛋白(HBc)、病毒聚合酶(Pol)和松弛環(huán)狀的病毒基因組DNA(rcDNA)組成的核衣殼構成，具有感染性；而管狀顆粒和小球型顆粒缺乏核衣殼結構，為HBsAg及膜結構構成的無傳染性亞病毒顆粒[8]。

HBV對肝細胞的特異性感染由病毒囊膜蛋白L-HBs的PreS1氨基端序列與肝細胞特異性表達的牛磺膽酸鈉共轉運蛋白(sodium taurocholate cotransporting polypeptide,NTCP)特異性結合所介導[9]。內化后的病毒核衣殼將rcDNA帶入細胞核形成共價閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)并做為病毒復制的模板。cccDNA可以轉錄出4種不同長度的病毒mRNA(3.5 kb、2.4 kb、2.1 kb和0.7 kb)。該轉錄過程受一系列的細胞因子調控，主要包括肝細胞核因子3(hepatocyte nuclear factor 3,HNF3)、HNF4、視黃酸X受體α、過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferators-activated receptors,PPAR)、肝X受體(liver X receptor,LXR)和法尼醇受體(farnesoid X receptor,FXR)等[10-15]。

在病毒的復制過程中，3.5 kb的前基因組RNA(pgRNA)可作為mRNA翻譯出HBV核心抗原(HBcAg)和P蛋白，同時也是逆轉錄合成子代病毒DNA的模板。首先，P蛋白與pgRNA的ε區(qū)結合并招募HBcAg形成核衣殼。隨后pgRNA在P蛋白反轉錄酶和DNA聚合酶活性的催化下在核衣殼內先后合成出HBV DNA的負鏈和正鏈，形成核衣殼。最后，帶有rcDNA的核衣殼進入細胞多囊泡小體(multivesicular body,MVB)被含有HBsAg的囊膜結構所包裹，以出芽的形式釋放出肝細胞。Dane顆粒通過依賴內吞體分選轉運復合體(endosomal sorting complex required for transport，ESCRT)途徑外泌，而裸衣殼的釋放并不需要上述ESCRT機制，而是涉及Alix和HGS的相關調控[16-17]。在亞病毒顆粒的釋放中，小球形顆粒主要經過內質網的一般分泌途徑進行，含有大表面抗原蛋白的管狀顆粒同樣可以經過ESCRT依賴性的途徑出胞[18]。

此外，對患者血漿中純化的HBV顆粒使用甲基-β-環(huán)糊精萃取膽固醇后病毒顆粒外觀無明顯變化，但出現了密度升高(1.23 g/ml vs 1.17 g/ml)和直徑降低(39 nm vs 48 nm)的現象，并失去感染性。盡管通過外源性添加膽固醇或膽固醇類似物可使病毒顆粒的密度及直徑恢復正常，但感染性無法得到恢復。上述研究提示，病毒的排出途徑與細胞膜分選機制密切相關，在釋放過程中需要大量的含膽固醇在內的宿主細胞脂質膜結構。并且，HBV的感染性與病毒包膜的膽固醇含量及結構有關[19]。

2 脂代謝的主要調節(jié)通路

肝臟是全身脂質代謝最重要的器官，參與脂質吸收、重構和分配。肝臟脂質的主要來源包括以乙酰輔酶A等為原料的從頭合成、腸道吸收后經載脂蛋白運輸并被肝細胞吸收。肝臟脂質合成代謝的異常與NAFLD的發(fā)生密切相關。其中從頭合成占肝細胞內總脂質的20%。

目前公認的脂肪酸合成限速酶有乙酰輔酶A羧化酶、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FASN)、硬脂酰輔酶A去飽和酶1等[20]。下列轉錄調控因子能夠通過作用于脂質從頭合成限速酶來發(fā)揮調控作用，包括LXR、碳水化合物反應元件結合蛋白、SREBP-1c、上游轉錄因子1/2等。

除了從頭合成，肝細胞還通過被動擴散，和輔助膜受體CD36、脂肪酸結合受體1(fatty acid binding protein 1,FABP1)介導下主動攝取脂肪酸[21]、由低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor,LDLR)介導的內吞作用從胞外攝取膽固醇，以及由低密度脂蛋白受體相關蛋白1介導的內吞乳糜微粒途徑來攝取甘油三酯[22]。

肝臟脂質的去路主要為以極低密度脂蛋白膽固醇形式輸送到其他肝外組織，以及通過β氧化代謝脂肪酸。在脂肪酸β氧化過程中，FABP將其所結合的脂肪酸帶入線粒體，隨后轉錄因子PPARα等通過調控限速酶如長鏈脂酰輔酶A脫氫酶、酰基輔酶A氧化酶和短鏈特異性酰基輔酶A脫氫酶影響脂肪酸β氧化過程。

總之，脂肪酸合成、攝入及分解受到一系列代謝相關酶類以及轉錄因子的調控。正常生理條件下，肝臟脂質維持平衡狀態(tài)。

3 HBV對脂代謝的影響

HBx是最早被發(fā)現可通過影響多個信號通路誘導肝細胞發(fā)生脂肪變性的病毒蛋白[23]。Kim等[24-25]的系列研究發(fā)現，HBx可通過增強核受體超家族成員LXR-α與LXRE的結合促進FASN及SREBP-1c轉錄，或通過TNFα及其受體1 (TNFR1)介導NF-κB通路的激活上調SREBP-1c和PPARγ的表達，從而動員胞內脂質的從頭合成，誘導肝細胞脂質堆積[26]。PI3K-Akt途徑是重要的細胞增殖、代謝調節(jié)通路，HBx還可以通過影響Akt對底物糖原合酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-β,GSK-β)的磷酸化失活，穩(wěn)定SREBP-1c核定位，并通過激活Akt下游哺乳動物雷帕霉素靶標復合物1刺激脂肪生成[27]。

烯酰輔酶A水合酶1位于線粒體基質中，是催化脂肪酸氧化的關鍵酶。HBsAg可能具有抑制烯酰輔酶A水合酶1活性、促進肝細胞脂質堆積的作用[28]。此外，Oehler等[29]利用人類肝臟嵌合小鼠模型發(fā)現，PreS1與NTCP的結合會干擾肝細胞膽汁酸的吸收，從而引起CYP7A1的表達上調，及SREBP-2、3-羥3-甲基戊二酰輔酶A還原酶和LDLR表達升高，進而促進膽固醇向膽汁酸的轉換，并同時促進膽固醇的從頭合成及胞外攝取。該研究還發(fā)現，HBV能夠從轉錄水平上調載脂蛋白A1。考慮到載脂蛋白A1是逆向運輸膽固醇回肝臟的重要載脂蛋白，其增加是否會促進脂質向肝細胞的運輸值得進一步研究。

4 脂質代謝通路對于HBV復制的影響

HBV基因組轉錄高度依賴于肝臟富集的代謝核受體。其中FXRa能夠增強HBV核心啟動子活性，進而提高pgRNA水平。研究[30]顯示，代謝調節(jié)分子和糖原異生關鍵基因的共激活因子PPARγ輔助激活因子1α(PPAR γ coactivator 1 α,PGC-1α)能夠在激活糖異生的同時，激活HBV相關基因HNF4α的表達，兩者協同促進BCP或EnhancerⅠ的轉錄活性。在Huh7細胞中，能量代謝傳感器SIRT1能夠以FXRα和PGC-1α依賴性方式激活核心啟動子，FXRa 激活劑GW4064能夠10倍提高核心啟動子活性，聯用SIRT1的特異性激活劑ACT3能夠進一步使核心啟動子控制的熒光素酶表達增加25倍[31]。

已知HBx可通過促進LXR-α與LXRE的結合進而促進FASN及SREBP-1c轉錄上調，動員胞內脂質的從頭合成和脂質堆積[24-25]。內源性LXR的激動劑氧固醇可以通過激活LXRα，進而影響HBV的基本核心啟動子的轉錄活性，上調HBx及3.5 kb mRNA的水平[32]。但也有研究[33]顯示，在HBV感染的人原代肝細胞中，LXR激動劑(T0901317、GW3965和LXR-623)而非LXR拮抗劑(SR9238)能夠降低胞內HBV RNA、HBV DNA和上清中的HBsAg及HBeAg水平。該研究進一步顯示，LXR激動劑可能是通過降低CYP7A1的mRNA及蛋白水平發(fā)揮其抗病毒作用。對于報導的LXR調控HBV作用的這些不一致性，還需進一步的相關研究確定。

過氧化物酶體增殖物激活受體PPAR包括PPARα、PPARβ/δ和PPARγ三種類型，是脂質代謝及炎癥反應相關的重要細胞因子[34]。其中PPARα主要位于肝臟，參與調節(jié)脂肪酸運輸、β-氧化和生酮作用。PPARγ在脂肪組織中高表達，參與脂肪儲存和脂肪因子的分泌。有研究[15]顯示，在不支持HBV復制的小鼠成纖維細胞NIH3T3中過表達外源PPARα后，可使之獲得支持HBV復制的能力。與之一致，通過Wy-14,643和氯鋇酸處理激活HBV轉基因小鼠的PPARα后，小鼠血清中的HBeAg及肝細胞內HBV DNA均出現了升高，而通過小干擾RNA抑制PPARα可抑制HBV復制[13]。此外，miR-141也可通過靶向抑制PPARα抑制HBV的復制[35]。

但用PPAR的激動劑苯扎貝特和羅格列酮處理細胞并未觀察到促進HBV復制的現象，羅格列酮處理甚至降低了培養(yǎng)上清液中HBV DNA、HBsAg和HBeAg水平，細胞中的HBV復制中間體也被抑制[36]。對于這種矛盾的現象，目前尚缺乏合理的解釋。此外，激活PPARγ也可以增強HBV穩(wěn)定轉染細胞的病毒復制能力[37]。

5 胞內脂質對HBV復制的影響

既往以HBV轉基因鼠或HBV超基因組質粒DNA尾靜脈水壓動力注射等聯合高脂飲食，構建NAFLD合并HBV復制小鼠模型，研究[38-39]結果顯示，合并脂肪肝小鼠的血清HBeAg、HBsAg及HBV DNA水平均出現明顯下降。這與臨床觀察到的HBV合并NALFD患者病毒載量較低的現象相符，提示胞內脂質水平對于HBV復制具有重要影響。由于胞內脂質種類繁多，對于不同種類脂質對于HBV復制的影響需進一步論述。

5.1 胞內膽固醇對于HBV復制的影響 使用競爭性的HMG-CoA還原酶抑制劑洛伐他汀(Lovastatin)抑制膽固醇合成，可降低HepG2.2.15細胞培養(yǎng)上清的HBsAg水平，但HBV DNA水平未見明顯變化[40]。進一步，用缺乏脂蛋白的血清培養(yǎng)HepG2.2.15可在24 h內使細胞內膽固醇水平降低40%，對應上清中的HBV DNA水平出現80%的下降，HBsAg的水平不受影響，這可能與膽固醇在維持L-HBs的拓撲結構中發(fā)揮的重要作用有關[41]。但在HepAD38細胞中，用膽固醇生成抑制劑NB598處理6天后培養(yǎng)上清的HBV DNA水平出現明顯下降，而HBsAg水平未受到影響[19,42]。

5.2 鞘脂對于HBV復制的影響 鞘脂可能以三種方式影響病毒復制：在病毒進入過程中充當(共)受體、調節(jié)病毒復制和影響病毒免疫應答。多項研究表明，鞘氨醇激酶及其產物鞘氨醇-1-磷酸可增強HBV、麻疹病毒和流感病毒的復制；神經酰胺尤其是鞘氨醇-1-磷酸和鞘氨醇激酶1，能夠通過增強樹突狀細胞的成熟、分化和在組織中的定位，影響IFN-Ⅰ的表達；除此以外，α-半乳糖基神經酰胺也具有刺激自然殺傷細胞活化和IFNγ分泌的作用。

絲氨酸棕櫚酰轉移酶(serine palmitoyl transferase,SPT)是催化鞘脂生物合成的第一步。研究[43]顯示，SPT抑制劑Myriocin可以降低轉染了HBV C基因型表達質粒的Huh7細胞培養(yǎng)上清液中的HBV DNA水平，與PEG-IFN聯用可進一步將HBV水平降低至對照水平的1/1000，并導致HBV表面抗原和核心蛋白水平的降低，同時不會引起肝毒性。另一種SPT抑制劑球殼菌素也能夠明顯降低上述Huh7細胞培養(yǎng)上清的HBV水平[44]。

5.3 磷脂對于HBV復制的影響 已知HBV利用宿主MVB途徑獲取帶有HBsAg的脂質包膜，而該包膜的90%以上由磷脂構成[45]。研究[46]表明，HBV復制可引起小鼠肝臟中磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine,PC)組成的改變，Huang等[47]進一步通過代謝組學確定了一組在CHB患者中成分或含量發(fā)生改變的生物標志物，主要包括溶血磷脂酰膽堿、磷脂酰膽堿、磷脂酰肌醇和磷脂酰絲氨酸。近期，他們在HepG2.2.15細胞中發(fā)現，抑制磷脂生成后HBV的復制受到了抑制[45]。

上述研究提示，磷脂在HBV復制及感染可能具有重要作用。PC是生物膜的主要磷脂成分。Li等[48]的研究發(fā)現,HepG2.2.15中PC的主要成分總脂肪酸含量明顯增加，表明在HBV復制的HepG2細胞中脂肪酸生物合成的增強。但目前尚缺少有關PC生物合成增加是否影響HBV復制的研究。

5.4 脂肪酸對于HBV復制的影響 脂肪酸是構成脂質膜的主要成分之一，因此長鏈脂肪酸對于形成病毒外包膜可能具有重要價值。鑒于前期研究中發(fā)現HBx具有通過激活SREBP1進而增強脂質合成相關基因表達的功能[25]，HBV也可能通過促進細胞脂肪酸的產生，為病毒復制提供充足的外包膜使其正常釋放[49]。另一基于Hep2.2.15細胞的實驗[50]同樣顯示，用脂肪酸從頭合成途徑的抑制劑FASN處理，在有效降低胞內長鏈脂肪酸水平的同時，培養(yǎng)上清HBV DNA水平降低至對照組的50%，HBsAg降低至80%，且上清中白蛋白水平未見影響，提示FASN抑制劑可能不通過抑制細胞蛋白質合成和分泌過程發(fā)揮作用。長鏈脂肪酸可能在Dane顆粒的形成或運輸過程中發(fā)揮作用，進而影響到Dane顆粒的釋放。

使用經誘導成熟分化的HepaRG細胞和原代人肝細胞的相關研究[51]發(fā)現，在感染及感染后2 h內在培養(yǎng)上清中添加富含脂質成分的載脂蛋白，在感染后第10天的檢測結果顯示，培養(yǎng)上清的HBeAg及胞內的cccDNA水平均明顯降低，提示富含脂質成分的載脂蛋白能夠抑制HBV對培養(yǎng)細胞的感染。因此HBV在感染過程中的進入細胞階段可能利用、甚至依賴細胞通過載脂蛋白攝取脂質的途徑。的確，使用脂肪酶抑制劑奧利司他處理來抑制細胞對脂肪的吸收后，細胞培養(yǎng)上清HBeAg及胞內cccDNA均下降，但如果在病毒感染細胞階段結束后再用奧利司他處理，其對于HBV復制活性的抑制作用消失，提示奧利司他是通過抑制病毒顆粒的進入、而不是通過影響HBV的基因表達或復制發(fā)揮作用。以上結果抑制脂肪酶可靶向HBV感染的早期步驟。

6 總結

我國的HBV感染仍處于較高流行階段[1]，隨著社會快速發(fā)展帶來的營養(yǎng)過剩和不良生活習慣的增加，慢性HBV感染者中合并NAFLD的患病率呈現逐年升高的態(tài)勢[2]。慢性HBV感染合并NAFLD，及其與之相關的肝纖維化、肝硬化及肝癌是目前及之后相當長時間影響我國公共衛(wèi)生的主要問題。因此，探究合并NALFD的CHB患者中HBV復制與脂代謝異常及脂肪肝發(fā)生的相互影響，具有重要的理論和現實意義。

HBV的生活周期涉及多個步驟，其中通過MVB途徑獲取包膜是感染性病毒顆粒的重要釋放途徑。從HBV與脂代謝的相互作用機制上看，HBx能夠在細胞模型及小鼠模型促進胞內脂質的從頭合成及體外攝取，進而增加脂質的胞內堆積[24]；反過來，脂代謝的重要調節(jié)通路如PPAR、LXR、FXR能夠在轉錄水平調節(jié)胞內HBV的復制[31-32]。

不同于體外及動物實驗中觀察到的,HBV具有促進脂質合成及攝入的能力，但多數臨床研究及系統綜述顯示，HBV感染者NAFLD發(fā)生率較低。上述矛盾現象可能與臨床研究中納入的HBV感染者或CHB患者的病毒載量及免疫狀態(tài)有所不同有關。未來需要更好的實驗模型，以便對臨床發(fā)現的HBV感染者NAFLD發(fā)病率較低、但一旦發(fā)生嚴重脂肪變及NASH后的慢性HBV感染者疾病進程嚴重化等現象進行解釋，并為更優(yōu)治療方式的選擇提供思路。同時，進一步明確脂代謝調節(jié)通路對HBV的影響，也將有助于HBV的藥物研發(fā)與抗病毒治療方式的選擇。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：魯鳳民參與文章設計及撰寫；文夏杰、李桂馨參與文獻檢索、資料總結及文章撰寫；賈繼東、饒慧瑛、李婕參與修改文章關鍵內容。