鏈形藻類的中國新記錄屬
——中眼藻屬

董曉琪 劉國祥 朱 歡

(1. 西藏大學理學院, 拉薩 850000; 2. 中國科學院藻類生物學重點實驗室, 武漢 430072; 3. 中國科學院大學, 北京 100049)

綠色植物界(Viridiplantae)是由綠藻門(Chlorophyta)和鏈形植物門(Streptophyta)組成的一類光合生物的統稱[1-6]。它主要由傳統意義上的低等綠藻(Green algae)和高等植物(Higher plants)組成, 后者通常又被稱之為有胚植物(Embryophyta)或陸生植物(Land plants)。根據Algaebase(https://www.algaebase.org/)和NCBI taxonomy(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy/)兩個數據庫所采用的分類系統, 這一定義中的綠藻(Green algae)分為兩大類群, 其一為傳統的綠藻門類群(即綠藻門, Chlorophyta), 它主要包括蔥綠藻(Prasinophytes)和核心綠藻(core Chlorophytes)兩個大類群; 其二為鏈形藻類(Streptophyta algae), 它主要包括廣義的輪藻門藻類(Charophytasensu lato), 即由輪藻綱(Charophyceae)、雙星藻綱(Zygnematophyceae)、鞘毛藻綱(Coleochaetophyceae)、克里藻綱(Klebsormidiophyceae)、綠方藻綱(Chlorokybophyceae)和中眼藻綱(Mesostigmatophyceae)六個類群的藻類組成。

被藻類學家廣為采納的綠藻分類系統逐漸脫離了依據形態特征所建立的框架, 并與基于鞭毛根系統(Flagellate root system)的超微結構研究和分子系統發育研究所建立的分類框架趨于一致[5,7,8]。而在這一系列的研究進程中, 蔥綠藻的分類與系統發育具有極為重要的意義。蔥綠藻的典型特征是原生質體外多由酸性多糖質的鱗片所包被, 且在光合作用產物、游動細胞形態上更為原始和多樣。越來越多的研究表明, 這一分類框架中的蔥綠藻為深度發生且高度并系的類群。蔥綠藻也被認為是綠色植物中最古老的類群[9-11]。

中眼藻屬最早被描述于1894年[12], 是一種鞭毛器(Flagellate apparatus)具有多層結構(Multi-layers structure, MLS)且有鱗包被的綠色藻類, 能產生并維持一個復雜的三層胞外基質, 由內部菱形鱗片、中部橢圓形鱗片和外部籃狀鱗片三種類型的鱗片組成[13,14]。在蔥綠藻中, 中眼藻屬被描述為一個特殊的類群, 其多糖質的鱗片與特殊的鞭毛位置使得藻類學家將其與其他蔥綠藻并列歸入綠藻門中。而基于鞭毛根系統的超微結構研究支持中眼藻與輪藻和高等植物具有更近的親緣關系, 分子系統發育的研究則進一步肯定了基于超微結構的研究結果[2]。近20年來絕大多數關于中眼藻的超微結構和分子生物學研究證實其為鏈形植物的一個分支, 而不是處于綠藻門支系中[15—17]。基于細胞器基因組數據和全基因組數據的系統發育基因組學研究更進一步支持中眼藻是鏈形植物門中最為原始的類群[18—20]。現在藻類學界普遍認為已經發現的單細胞鞭毛藻中, 中眼藻是與高等植物親緣關系最近的藻類[21]。

中眼藻主要分布于靜止的淡水水體中, 諸如池塘、水庫和小型湖泊等[22]。本研究對采自重慶合川和福建九龍江水庫的標本進行了形態觀察和分子系統發育分析, 描述了中眼藻的形態特征和系統發育位置; 同時以三峽水庫為例, 應用環境DNA技術檢測了中眼藻在水庫中的時空分布情況。這是中眼藻屬在中國的首次報道。

1 材料與方法

1.1 材料采集與形態觀察

采集中眼藻樣品使用25號浮游生物網, 采集后的標本一部分用福爾馬林加10%的甘油固定用于形態觀察, 另一部分用無水乙醇固定用于DNA提取。樣品采集信息見表 1。環境DNA采集與樣品處理方法參見Hu等[23], 采集信息見表 2。形態觀察在光學顯微鏡(DM5000B: Leica, Wetzlar, Germany)下進行, 由于中眼藻細胞較小, 使用油鏡(100×)對其進行觀察; 利用Leica DFC320數碼相機對藻體形態特征、藻體顏色、長寬比例和藻體內部結構等具有辨識度的特征進行拍攝。

表1 中眼藻標本信息及GenBank登錄號Tab. 1 Sample time of the studied specimens and GenBank accession number

表2 環境DNA采集信息詳情Tab. 2 Details of environmental DNA collection

1.2 單細胞PCR擴增及測序

模板DNA制備: 在倒置顯微鏡下確定目標藻體, 用孔徑約0.1 mm的微吸管吸取單細胞直到提取出的細胞僅為中眼藻1種, 用移液槍吸取50 μL含有細胞的緩沖液(PBS)至PCR管中, 加入2 μL裂解緩沖液(Vazyme, Nanjing, China), 95 ℃熱處理15min, 處理后將獲取的DNA模板保存于-20 ℃冰箱中備用。

PCR擴增體系共50 μL, 其中包含正反向引物各1.5 μL, 引物最終濃度為0.4 μmol/L; 4 μL模板DNA; 25 μL2×TaqMaster Mix(ExTaq, TaKaRa,Dalian, China); 無菌雙蒸水18 μL。18S rDNA擴增引物及反應條件參照Honda等[24]。

PCR 擴增產物經1.0%的瓊脂糖凝膠電泳, 根據條帶長度切下目標條帶, 凝膠回收試劑盒回收(E.Z.N.A. Gel Extraction Kit Omega Bio-Tek, America)并純化PCR產物后送至擎科生物公司測序(TSING KE, Wuhan, China), 測序后的序列上傳至GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)。環境DNA的提取及測序方法參見Hu等[23]。環境DNA序列上傳至NCBI數據庫, 其Bioproject Accession為PRJNA496371。

1.3 數據分析

使用NCBI核酸數據庫對18S rDNA基因序列進行BLAST相似性對比, 下載相似度高的序列片段,首先使用MAFFT 7.4對序列矩陣進行比對[25], 然后使用MEGA 7.0軟件對序列進行手動校正[26], 在DAMBE5.0中對數據質量進行評估[27]。使用ModelFinder軟件選擇最適模型[28]。采用最大似然法(Maximum likelihood, ML)和貝葉斯法構建系統進化樹, 最大似然法使用軟件為 RAxML 8.0[29], 貝葉斯法使用 MrBayes 3.2[30]。

2 結果

2.1 形態觀察

中眼藻屬

Mesostigma Lauterborn 1894

Lauterborn, R. Ueber die Winterfauna einiger Gew?sser der Oberrheinebene. Mit Beschreibungen neuer Protozoen. Biologische Centralblatt, 1894, 14:390—398

Holotype species:Mesostigma virideLauterborn 1894

細胞扁平到鞍形, 從背側凹陷處伸出2條鞭毛。腹面略凹。鞭毛基部位置靠近細胞前端, 鞭毛或多或少地指向運動細胞的前部, 該運動細胞在運動過程中會快速旋轉。葉綠體單個, 覆蓋腹側和外側, 并延伸到背側。腹側具單個眼點, 靠近細胞的中軸。鞭毛基部附近有幾個伸縮泡。在模式種中存在2個蛋白核, 而其他物種則缺乏蛋白核。細胞和鞭毛覆蓋著多種類型的鱗片。原生質體最外層的鱗片足夠大, 以至于在光學顯微鏡下可見。繁殖方式未知。

該屬為中國新記錄屬。根據Algaebase在線數據庫的記錄有Mesostigma virideLauterborn和Mesostigma grandeKorshikov兩種, 區分這兩種的關鍵特征在于蛋白核數量不同。亦有藻類學家認為中眼藻屬為單種屬,M. grande為M. viride的異名。

綠色中眼藻(圖 1a—i)

圖1 本研究中采集的綠色中眼藻的形態特征Fig. 1 The morphological characteristics of Mesostigma viride cells

Mesostigma viride Lauterborn 1894

Lauterborn, R. Ueber die Winterfauna einiger Gew?sser der Oberrheinebene. Mit Beschreibungen neuer Protozoen. Biologische Centralblatt, 1894, 14:390—398

細胞扁平, 橢圓形或圓形, 稍不對稱, 呈黃綠色,細胞長14—20 μm, 寬11—16 μm(圖 1a、1b和1c);原生質體外無細胞壁, 而是由多糖質鱗片包被(圖 1e),且鱗片呈網狀(圖 1h); 細胞內具1個大液泡(圖 1c),2—4個伸縮泡(圖 1g)及2個蛋白核(圖 1d); 葉綠體1個, 暗綠色, 片狀, 周生; 細胞腹側中軸處具1個眼點(圖 1a); 背側凹陷處具兩根鞭毛(圖 1i), 呈螺旋形前進(可見其側面觀圖 1f)。以上特征與中眼藻(Mesostigma viride)形態特征符合, 故可判斷該藻為中眼藻。

該種為中國新記錄種。

2.2 分子系統發育分析

兩株中眼藻的18S rDNA序列長度分別為1649 bp(MW413341)和1605 bp(MW413342)。從環境樣本中獲得的18S rDNA V4區的5條序列長度分別為381 bp(Zotu1588)、382 bp(Zotu2528)、381 bp(Zotu 2676)、380 bp(Zotu3287)和380 bp(Zotu5259)。NCBI核酸數據庫對基因序列進行相似性對比顯示以上7條序列與GenBank中已有的中眼藻序列相似度為100%。用于構建系統發育樹的序列矩陣信息見表 3。

表3 構建系統發育樹數據詳情Tab. 3 Details of the data used to build phylogenetic trees

基于中眼藻18S rDNA序列構建的系統進化樹(圖 2), 運用最大似然法和貝葉斯法得到的拓撲結構基本一致。本實驗所采集到的2株藻與Gen-Bank中已有的中眼藻KJ808698Mesostigma viride聚在一起, 其自展支持值和后驗概率分別為100和1.00, 支持本實驗所采集藻類為綠色中眼藻。從系統進化樹可以明顯地看出, 中眼藻綱(Mesostigmatophyceae)與綠方藻綱 (Chlorokybophyceae)以較高的自展支持值和后驗概率聚為一枝。環境DNA系統發育樹結果顯示(圖 3), 5個不同的環境序列均以較高的自展支持值與綠色中眼藻聚在一起。另外, 通過對三峽水庫4個季節的環境DNA調查, 我們發現中眼藻在秋季出現的頻率最高,夏季僅在1個樣品中檢測到, 而冬春季節均未發現該藻。

圖2 基于中眼藻18S rDNA序列構建的系統進化樹Fig. 2 The phylogram inferred from18S rDNA sequences of Mesostigma viride

圖3 基于環境中18S rDNA構建的系統發育樹Fig. 3 The phylogram inferred from 18S rDNA sequences of environmental DNA

3 討論

不同于鞭毛位置位于細胞前端的綠藻, 中眼藻鞭毛位于背部凹陷處, 這使得其運動方式表現為特殊的螺旋式前進, 可作為區分中眼藻與其他常見單細胞鞭毛綠藻的重要特征。由于原生質體外不具由纖維素和果膠組成的細胞壁, 中眼藻最初被認為隸屬于蔥綠藻綱[31], 但分子系統發育研究表明這一類群并不是自然發生的。本研究結果表明, 中眼藻與鏈形植物門中的輪藻綱和綠方藻綱具有更近的親緣關系, 進一步支持中眼藻在系統發育位置上處于鏈形植物門的基部, 這與Bhattacharya等[18]對中眼藻肌動蛋白的研究和Nedelcu 等[16]對中眼藻表達序列標簽(Expressed Sequence Tags, EST)的研究結果一致。

依據環境樣本中獲取的18S rDNA V4區片段,我們發現三峽水庫多個區域存在中眼藻, 且主要出現在秋季。然而我們通過顯微觀察卻并未在這些水體中發現中眼藻, 這表明中眼藻可能比我們預期中要更難發現, 同時也說明秋季可能是在中國內陸采集中眼藻的最佳季節。不同18S rDNA V4區序列在系統發育樹上的位置略有區別, Zotu 3287和Zotu5259以72的自展支持值與AF408245Mesostigma viride聚為一枝; Zotu1588、Zotu2676和Zotu2528以79的自展支持值及90%的貝葉斯后驗概率與本研究中采集到的中眼藻聚為一枝; 而以上兩大分枝以99的自展支持值及100%的后驗概率分為兩枝, 這暗示了中眼藻屬中有可能存在隱存種。在以后的研究工作中, 應用單細胞PCR手段獲取多個分子標記進行詳細比較, 同時獲取更為精細的顯微特征數據, 對于解決這一問題可能較為有效。

目前, 對于中眼藻系統發育的研究結果表明中眼藻在鏈形植物類群中單獨形成一個深度發生的枝系, 與陸生植物有著密不可分的聯系, 是研究綠色植物從水生綠藻向陸生植物過渡的理想材料。本研究首次在中國發現并記錄了中眼藻屬,對中眼藻在中國內陸水體的分布和出現時間進行了初步推測, 為在中國開展中眼藻相關研究奠定基礎。